Immunomodulatoryske metaboliten binne in wichtich skaaimerk fan 'e tumor-mikroomjouwing (TME), mar mei in pear útsûnderings bliuwe har identiteiten foar in grut part ûnbekend. Hjir hawwe wy tumors en T-sellen analysearre út 'e tumors en ascites fan pasjinten mei hege-graad sereus karsinoom (HGSC) om it metaboloom fan dizze ferskillende TME-kompartiminten te iepenbierjen. Ascites en tumorsellen hawwe wiidweidige metaboliteferskillen. Yn ferliking mei ascites binne de tumor-ynfiltrearjende T-sellen signifikant ferrike mei 1-methylnicotinamide (MNA). Hoewol it nivo fan MNA yn T-sellen ferhege is, is de ekspresje fan nicotinamide N-methyltransferase (in enzyme dat de oerdracht fan methylgroepen fan S-adenosylmethionine nei nicotinamide katalysearret) beheind ta fibroblasten en tumorsellen. Funksjoneel ynducearret MNA T-sellen om de tumor-befoarderjende cytokine tumornekrosefaktor alfa út te skieden. Dêrom draacht TME-ôflaat MNA by oan 'e ymmúnregeling fan T-sellen en fertsjintwurdiget in potinsjeel immunoterapy-doel foar de behanneling fan minsklike kanker.
Tumor-ôflaatte metaboliten kinne in djipgeande remmende effekt hawwe op anty-tumor-immuniteit, en mear en mear bewiis lit sjen dat se ek kinne tsjinje as in wichtige driuwende krêft foar sykteprogresje (1). Neist it Warburg-effekt is resint wurk begûn om de metabolike steat fan tumorsellen te karakterisearjen en syn relaasje mei de ymmúnsteat fan 'e tumor-mikroomjouwing (TME). Undersyk nei mûsmodellen en minsklike T-sellen hat oantoand dat glutaminemetabolisme (2), oksidatyf metabolisme (3) en glukosemetabolisme (4) ûnôfhinklik kinne ynteraksje op ferskate ymmúnsel-subgroepen. Ferskate metaboliten yn dizze paden remme de anty-tumorfunksje fan T-sellen. It is bewiisd dat de blokkade fan it koënzym tetrahydrobiopterin (BH4) de proliferaasje fan T-sellen kin beskeadigje, en de tanimming fan BH4 yn it lichem kin de anty-tumor-ymmúnreaksje bemiddele troch CD4 en CD8 ferbetterje. Derneist kin it ymmúnsuppressive effekt fan kynurenine rêden wurde troch de administraasje fan BH4 (5). Yn in isocitraatdehydrogenase (IDH) mutant glioblastoom remt de útskieding fan enantiometaboal (R)-2-hydroxyglutaraat (R-2-HG) T-selaktivaasje, proliferaasje en cytolyseaktiviteit (6). Koartlyn is oantoand dat methylglyoxal, in byprodukt fan glykolyse, produsearre wurdt troch suppressorsellen fan myeloïde oarsprong, en T-seloerdracht fan methylglyoxal kin de effektor T-selfunksje remme. Yn behanneling kin de neutralisaasje fan methylglyoxal de aktiviteit fan myeloïde-ôflaatte suppressorsellen (MDSC) oerwinne en synergistysk checkpoint-blokkadeterapy yn mûsmodellen ferbetterje (7). Dizze stúdzjes beklamje kollektyf de kaairol fan TME-ôflaatte metaboliten by it regeljen fan T-selfunksje en -aktiviteit.
T-seldysfunksje is breed rapportearre by eierstokkanker (8). Dit komt foar in part troch de metabolike skaaimerken dy't ynherent binne oan hypoxia en abnormale tumorvaskulatuer (9), wat resulteart yn 'e konverzje fan glukoaze en tryptofaan yn byprodukten lykas molksûr en kynurenine. Oermjittige ekstrasellulêre laktaat ferminderet de produksje fan interferon-γ (IFN-γ) en driuwt de differinsjaasje fan myelosuppressive subgroepen oan (10, 11). De konsumpsje fan tryptofaan remt direkt T-selproliferaasje en remt T-selreseptorsignalisaasje (12-14). Nettsjinsteande dizze observaasjes is in soad wurk om ymmúnmetabolisme hinne útfierd yn in vitro T-selkultuer mei optimalisearre media, of beheind ta homologe mûsmodellen yn vivo, dy't gjin fan beide de heterogeniteit fan minsklike kankers en fysiologyske makro- en mikro-omjouwing folslein reflektearje.
In mienskiplik skaaimerk fan eierstokkanker is peritoneale fersprieding en it ferskinen fan ascites. De opgarjen fan selfloeistof yn ascites wurdt assosjeare mei avansearre sykte en in minne prognose (15). Neffens rapporten is dit unike kompartimint hypoksysk, hat it hege nivo's fan vaskulêre endotheliale groeifaktor (VEGF) en indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), en wurdt it infiltrearre troch T-regulearjende sellen en myeloïde remmende sellen (15-18). De metabolike omjouwing fan ascites kin oars wêze as dy fan 'e tumor sels, sadat de reprogrammearring fan T-sellen yn 'e peritoneale romte ûndúdlik is. Derneist kinne de wichtichste ferskillen en heterogeniteit tusken ascites en metaboliten oanwêzich yn 'e tumoromjouwing de infiltraasje fan ymmúnsellen en har funksje op tumors hinderje, en fierder ûndersyk is nedich.
Om dizze problemen op te lossen, hawwe wy in gefoelige selskieding en floeistofchromatografy tandem massaspektrometry (LC-MS/MS) metoade ûntworpen om ferskate seltypen (ynklusyf CD4+ en CD8+ T-sellen) te bestudearjen, lykas binnen en tusken tumors. De metaboliten omfetsje sellen yn deselde ascites- en tumoromjouwing fan 'e pasjint. Wy brûke dizze metoade yn kombinaasje mei heech-dimensionale streamcytometry en single-cell RNA-sekwinsjering (scRNA-seq) om in heechoplost portret te jaan fan 'e metabolike status fan dizze wichtige populaasjes. Dizze metoade liet in wichtige tanimming sjen fan it nivo fan 1-methylnicotinamide (MNA) yn tumor T-sellen, en in vitro-eksperiminten lieten sjen dat it immunomodulatoryske effekt fan MNA op T-selfunksje earder ûnbekend wie. Yn 't algemien lit dizze metoade de ûnderlinge metabolike ynteraksjes tusken tumors en ymmúnsellen sjen, en jout unike ynsjoch yn ymmúnregulearringsmetaboliten, dy't nuttich kinne wêze foar de behanneling fan T-sel-basearre eierstokkanker-immunoterapy Behannelingsmooglikheden.
Wy brûkten heechdimensjonale streamcytometry om tagelyk glukoseopname te kwantifisearjen [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) en mitochondriale aktiviteit [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) binne typyske markers neist elkoar dy't ymmúnsellen en tumorselpopulaasjes ûnderskiede (Tabel S2 en Figuer S1A). Dizze analyze liet sjen dat ascites en tumorsellen yn ferliking mei T-sellen hegere glukoseopnamenivo's hawwe, mar lytsere ferskillen yn mitochondriale aktiviteit. De gemiddelde glukoseopname fan tumorsellen [CD45-EpCAM (EpCAM)+] is trije oant fjouwer kear dy fan T-sellen, en de gemiddelde glukoseopname fan CD4+ T-sellen is 1,2 kear dy fan CD8+ T-sellen, wat oanjout dat tumor-infiltrearjende lymfocyten (TIL) ferskillende metabolike easken hawwe, sels yn deselde TME (Figuer 1A). Yn tsjinstelling ta dit is de mitochondriale aktiviteit yn tumorsellen fergelykber mei dy fan CD4 + T-sellen, en de mitochondriale aktiviteit fan beide seltypen is heger as dy fan CD8 + T-sellen (figuer 1B). Yn 't algemien litte dizze resultaten it metabolike nivo sjen. De metabolike aktiviteit fan tumorsellen is heger as dy fan CD4 + T-sellen, en de metabolike aktiviteit fan CD4 + T-sellen is heger as dy fan CD8 + T-sellen. Nettsjinsteande dizze effekten oer seltypen, is der gjin konsekwint ferskil yn 'e metabolike status fan CD4 + en CD8 + T-sellen of har relative proporsjes yn ascites yn ferliking mei tumors (figuer 1C). Yn tsjinstelling, yn 'e CD45-selfraksje, naam it oandiel fan EpCAM + sellen yn 'e tumor ta yn ferliking mei ascites (figuer 1D). Wy seagen ek in dúdlik metabolysk ferskil tusken EpCAM + en EpCAM- selkomponinten. EpCAM + (tumor) sellen hawwe hegere glukoseopname en mitochondriale aktiviteit as EpCAM- sellen, wat folle heger is as de metabolike aktiviteit fan fibroblasten yn tumorsellen yn TME (figuer 1, E en F).
(A en B) Mediane fluoreszinsje-yntensiteit (MFI) fan glukose-opname (2-NBDG) (A) en mitochondriale aktiviteit fan CD4 + T-sellen (MitoTracker donkerread) (B) Represintative grafyken (lofts) en tabelgegevens (Rjochts), CD8 + T-sellen en EpCAM + CD45-tumorsellen fan ascites en tumor. (C) De ferhâlding fan CD4 + en CD8 + sellen (fan CD3 + T-sellen) yn ascites en tumor. (D) Oanpart fan EpCAM + tumorsellen yn ascites en tumor (CD45−). (E en F) EpCAM + CD45-tumor en EpCAM-CD45-matrix glukose-opname (2-NBDG) (E) en mitochondriale aktiviteit (MitoTracker donkerread) (F) represintative grafyken (lofts) en tabelgegevens (Rjochts) Ascites en tumorsellen. (G) Represintative grafyken fan CD25-, CD137- en PD1-ekspresje troch flowcytometry. (H en I) CD25, CD137 en PD1 ekspresje op CD4 + T-sellen (H) en CD8 + T-sellen (I). (J en K) Naive, sintraal ûnthâld (Tcm), effektor (Teff) en effektor ûnthâld (Tem) fenotypen basearre op 'e ekspresje fan CCR7 en CD45RO. Represintative ôfbyldings (lofts) en tabelgegevens (rjochts) fan CD4 + T-sellen (J) en CD8 + T-sellen (K) yn ascites en tumors. P-wearden bepaald troch paired t-test (*P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). De line fertsjintwurdiget oerienkommende pasjinten (n = 6). FMO, fluoreszinsje minus ien; MFI, mediane fluoreszinsje-yntensiteit.
Fierdere analyze liet oare wichtige ferskillen sjen tusken de heech oploste fenotypyske status fan T-sellen. It aktivearre (figuer 1, G oant I) en effektorûnthâld (figuer 1, J en K) yn tumors komme folle faker foar as ascites (ferhâlding fan CD3 + T-sellen). Op deselde wize liet it analysearjen fan it fenotype troch de ekspresje fan aktivearringsmarkers (CD25 en CD137) en depleasjemarkers [programmearre seldeadeprotein 1 (PD1)] sjen dat hoewol de metabolike skaaimerken fan dizze populaasjes oars binne (figuer S1, B oant E), mar gjin wichtige metabolike ferskillen konsekwint waarden waarnommen tusken naive, effektor- of ûnthâldsubsets (figuer S1, F oant I). Dizze resultaten waarden befêstige troch it brûken fan masinelearmetoaden om automatysk selfenotypen ta te wizen (21), wat fierder de oanwêzigens fan in grut oantal bienmergsellen (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) yn 'e ascites fan' e pasjint liet sjen (figuer S2A). Fan alle identifisearre seltypen liet dizze myeloïde selpopulaasje de heechste glukoseopname en mitochondriale aktiviteit sjen (figuer S2, B oant G). Dizze resultaten markearje de sterke metabolike ferskillen tusken de meardere seltypen dy't fûn binne yn ascites en tumors yn HGSC-pasjinten.
De wichtichste útdaging by it begripen fan 'e metabonomyske skaaimerken fan TIL is de needsaak om T-selmonsters fan foldwaande suverens, kwaliteit en kwantiteit te isolearjen fan tumors. Resinte stúdzjes hawwe oantoand dat sortear- en kralenferrikingsmetoaden basearre op flowcytometry kinne liede ta feroaringen yn sellulêre metabolietprofilen (22-24). Om dit probleem te oerwinnen, hawwe wy de kralenferrikingsmetoade optimalisearre om TIL te isolearjen en te isolearjen fan sjirurgysk resekteare minsklike eierstokkanker foarôfgeand oan analyze troch LC-MS/MS (sjoch Materialen en Metoaden; Figuer 2A). Om de algemiene ynfloed fan dit protokol op metabolietferoarings te beoardieljen, hawwe wy de metabolietprofilen fan T-sellen aktivearre troch sûne donors nei de boppesteande kralenskiedingsstap fergelike mei sellen dy't net kralenskieden waarden, mar op iis bleaunen. Dizze kwaliteitskontrôle-analyze fûn dat d'r in hege korrelaasje is tusken dizze twa omstannichheden (r = 0,77), en de technyske werhelberens fan 'e groep fan 86 metaboliten hat in hege werhelberens (Figuer 2B). Dêrom kinne dizze metoaden krekte metabolietanalyse útfiere yn sellen dy't seltypeferriking ûndergeane, wêrtroch't it earste platfoarm mei hege resolúsje levere wurdt foar it identifisearjen fan spesifike metaboliten yn HGSC, wêrtroch minsken in djipper begryp krije kinne fan selspesifisiteit fan it seksuele metabolismeprogramma.
(A) Skematysk diagram fan ferriking mei magnetyske kralen. Foar analyse troch LC-MS/MS sille de sellen trije opienfolgjende rûndes fan ferriking mei magnetyske kralen ûndergean of op iis bliuwe. (B) It effekt fan it ferrikingstype op 'e oerfloed fan metaboliten. It gemiddelde fan trije mjittingen foar elk ferrikingstype ± SE. De grize line stiet foar in 1:1 relaasje. De intra-klasse korrelaasje (ICC) fan werhelle mjittingen werjûn yn it aslabel. NAD, nicotinamide adenine dinukleotide. (C) Skematysk diagram fan 'e workflow fan pasjintmetabolietanalyse. Ascites of tumors wurde sammele fan pasjinten en kryopreservearre. In lyts diel fan elk stekproef waard analysearre troch flowcytometry, wylst de oerbleaune stekproeven trije rûndes fan ferriking ûndergien foar CD4+, CD8+ en CD45- sellen. Dizze selfraksjes waarden analysearre mei LC-MS/MS. (D) Waarmtekaart fan standerdisearre metabolietoerfloed. It dendrogram stiet foar Ward's klustering fan Euklidyske ôfstannen tusken stekproeven. (E) Haadkomponintanalyse (PCA) fan 'e metabolietkaart fan it stekproef, dy't trije replikaten fan elk stekproef sjen lit, stekproeven fan deselde pasjint binne ferbûn troch in line. (F) De PCA fan it metabolietprofyl fan it stekproef kondisjonearre oan 'e pasjint (d.w.s. mei gebrûk fan partielle redundânsje); it stekproeftype wurdt beheind troch de konvekse romp. PC1, haadkomponint 1; PC2, haadkomponint 2.
Folgjende hawwe wy dizze ferrikingsmetoade tapast om 99 metaboliten te analysearjen yn 'e CD4+, CD8+ en CD45-selfraksjes yn 'e primêre ascites en tumors fan seis HGSC-pasjinten (figuer 2C, figuer S3A en tabel S3 en S4). De populaasje fan belang is goed foar 2% oant 70% fan 'e orizjinele grutte stekproef fan libbene sellen, en it oandiel sellen ferskilt sterk tusken pasjinten. Nei it skieden fan 'e kralen is de ferrike fraksje fan belang (CD4+, CD8+ of CD45-) goed foar mear as 85% fan alle libbene sellen yn 'e stekproef gemiddeld. Dizze ferrikingsmetoade lit ús selpopulaasjes analysearje fan minsklik tumorweefselmetabolisme, wat ûnmooglik is om te dwaan fan grutte stekproeven. Mei dit protokol hawwe wy bepaald dat l-kynurenine en adenosine, dizze twa goed karakterisearre immunosuppressive metaboliten, ferhege wiene yn tumor T-sellen of tumorsellen (figuer S3, B en C). Dêrom demonstrearje dizze resultaten de trou en it fermogen fan ús selskiedings- en massaspektrometrytechnology om biologysk wichtige metaboliten yn pasjintweefsels te finen.
Us analyze liet ek in sterke metabolike skieding fan seltypen binnen en tusken pasjinten sjen (figuer 2D en figuer S4A). Benammen, yn ferliking mei oare pasjinten, liet pasjint 70 ferskillende metabolike skaaimerken sjen (figuer 2E en figuer S4B), wat oanjout dat der substansjele metabolike heterogeniteit tusken pasjinten kin wêze. It is it neamen wurdich dat yn ferliking mei oare pasjinten (1,2 oant 2 liter; tabel S1), de totale hoemannichte ascites dy't by pasjint 70 sammele waard (80 ml) lytser wie. De kontrôle fan heterogeniteit tusken pasjinten tidens haadkomponintanalyze (bygelyks mei gebrûk fan partielle redundânsjeanalyze) lit konsekwinte feroaringen sjen tusken seltypen, en de seltypen en/of mikroomjouwing binne dúdlik aggregearre neffens it metabolietprofyl (figuer 2F). De analyze fan ienkele metaboliten beklamme dizze effekten en liet wichtige ferskillen sjen tusken seltypen en mikroomjouwing. It is it neamen wurdich dat it meast ekstreme ferskil dat waarnommen is MNA is, dat meastentiids ferrike is yn CD45- sellen en yn CD4+ en CD8+ sellen dy't de tumor infiltrearje (figuer 3A). Foar CD4+ sellen is dit effekt it dúdlikst, en de MNA yn CD8+ sellen liket ek sterk beynfloede te wurden troch de omjouwing. Dit is lykwols net wichtich, om't mar trije fan 'e seis pasjinten evaluearre wurde kinne foar tumor CD8+ skoares. Neist MNA binne yn ferskate soarten sellen yn ascites en tumors ek oare metaboliten dy't min karakterisearre binne yn TIL ferskillend ryk (Figuren S3 en S4). Dêrom litte dizze gegevens in beloftefolle set fan immunomodulatoryske metaboliten sjen foar fierder ûndersyk.
(A) Normalisearre ynhâld fan MNA yn CD4+, CD8+ en CD45- sellen fan ascites en tumor. De doazeplot lit de mediaan (line), ynterkwartielberik (frame hinge) en databerik sjen, oant 1,5 kear it ynterkwartielberik (frame whisker). Lykas beskreaun yn Pasjintmaterialen en Metoaden, brûk de limmawearde fan 'e pasjint om de P-wearde te bepalen (*P<0,05 en **P<0,01). (B) Skematysk diagram fan MNA-metabolisme (60). Metaboliten: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteïne; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononukleotide. Enzymen (grien): NNMT, nikotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuinen; NAMPT, nikotinamide fosforibosyltransferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nikotinamide riboside kinase; NMNAT, nikotinamide mono Nukleotide adenylaattransferase; Pnp1, purine nukleoside fosforylase. (C) t-SNE fan scRNA-seq fan ascites (griis) en tumor (read; n = 3 pasjinten). (D) NNMT-ekspresje yn ferskate selpopulaasjes identifisearre mei scRNA-seq. (E) Ekspresje fan NNMT en AOX1 yn SK-OV-3, minsklike embryonale nier (HEK) 293T, T-sellen en MNA-behannele T-sellen. De opfolde ekspresje wurdt werjûn relatyf oan SK-OV-3. It ekspresjepatroan mei SEM wurdt werjûn (n = 6 sûne donors). Ct-wearden grutter as 35 wurde beskôge as net-detektearber (UD). (F) Ekspresje fan SLC22A1 en SLC22A2 yn SK-OV-3, HEK293T, T-sellen en T-sellen behannele mei 8mM MNA. De opfolde ekspresje wurdt werjûn relatyf oan SK-OV-3. It ekspresjepatroan mei SEM wurdt werjûn (n = 6 sûne donors). Ct-wearden grutter as 35 wurde beskôge as net-detektearber (UD). (G) Sel-MNA-ynhâld yn aktivearre sûne donor-T-sellen nei 72 oeren ynkubaasje mei MNA. It ekspresjepatroan mei SEM wurdt werjûn (n = 4 sûne donors).
MNA wurdt produsearre troch de metylgroep oer te dragen fan S-adenosyl-1-methionine (SAM) nei nicotinamide (NA) troch nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figuer 3B). NNMT wurdt oerekspressearre yn in ferskaat oan minsklike kankers en wurdt assosjeare mei proliferaasje, ynvaazje en metastase (25-27). Om de boarne fan MNA yn T-sellen yn TME better te begripen, hawwe wy scRNA-seq brûkt om de ekspresje fan NNMT oer seltypen te karakterisearjen yn 'e ascites en tumors fan trije HGSC-pasjinten (Tabel S5). Analyse fan sawat 6.500 sellen liet sjen dat yn ascites- en tumoromjouwings NNMT-ekspresje beheind wie ta de fermoede fibroblast- en tumorselpopulaasjes (Figuer 3, C en D). It is it neamen wurdich dat d'r gjin dúdlike NNMT-ekspresje is yn hokker populaasje dan ek dy't PTPRC (CD45 +) ekspressearret (Figuer 3D en Figuer S5A), wat oanjout dat de MNA dy't yn it metabolietspektrum detektearre is, yn T-sellen ynfierd is. De ekspresje fan aldehyde-oksidase 1 (AOX1) konvertearret MNA yn 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) of 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Figuer 3B) is ek beheind ta de populaasje fan fibroblasten dy't COL1A1 ekspressearje (Figuer S5A), dy't tegearre oanjaan dat T-sellen it fermogen fan konvinsjoneel MNA-metabolisme misse. It ekspresjepatroan fan dizze MNA-relatearre genen waard ferifiearre mei in twadde ûnôfhinklike seldataset fan ascites fan HGSC-pasjinten (Figuer S5B; n = 6) (16). Derneist liet kwantitative polymerasekettingreaksje (qPCR)-analyze fan sûne donor-T-sellen behannele mei MNA sjen dat yn ferliking mei kontrôle SK-OV-3 eierstoktumorsellen, NNMT of AOX1 hast net útdrukt waard (Figuer 3E). Dizze ûnferwachte resultaten jouwe oan dat MNA útskieden wurde kin fan fibroblasten of tumors yn oanbuorjende T-sellen yn TME.
Hoewol kandidaten de famylje fan organyske kationtransporters 1 oant 3 (OCT1, OCT2 en OCT3) omfetsje dy't kodearre wurde troch de oplosbere drager 22 (SLC22) famylje (SLC22A1, SLC22A2 en SLC22A3), binne de potinsjele transporters fan MNA noch net definieare (28). QPCR fan mRNA fan sûne donor T-sellen liet lege ekspresjenivo's fan SLC22A1 sjen, mar net-detektearbere nivo's fan SLC22A2, wat befêstige dat it earder rapportearre wie yn 'e literatuer (figuer 3F) (29). Yn tsjinstelling, de SK-OV-3 eierstoktumorselline ekspressearre hege nivo's fan beide transporters (figuer 3F).
Om de mooglikheid te testen dat T-sellen it fermogen hawwe om frjemd MNA op te nimmen, waarden sûne donor-T-sellen 72 oeren kultivearre yn 'e oanwêzigens fan ferskillende konsintraasjes MNA. By it ûntbrekken fan eksogene MNA kin de sellulêre ynhâld fan MNA net wurde detektearre (figuer 3G). Aktivearre T-sellen behannele mei eksogene MNA lieten lykwols in dosisôfhinklike tanimming fan MNA-ynhâld yn 'e sellen sjen, oant 6 mM MNA (figuer 3G). Dit resultaat jout oan dat nettsjinsteande it lege nivo fan transporter-ekspresje en it ûntbrekken fan it wichtichste enzyme dat ferantwurdlik is foar intrasellulêr MNA-metabolisme, TIL noch altyd MNA kin opnimme.
It spektrum fan metaboliten yn 'e T-sellen fan pasjinten en in vitro MNA-absorpsje-eksperiminten fergrutsje de mooglikheid dat kanker-assosjeare fibroblasten (CAF) MNA útskiede en tumorsellen kinne it fenotype en de funksje fan TIL regelje. Om it effekt fan MNA op T-sellen te bepalen, waarden sûne donor-T-sellen in vitro aktivearre yn 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan MNA, en waarden har proliferaasje en cytokineproduksje evaluearre. Nei 7 dagen fan it tafoegjen fan MNA by de heechste doasis, wie it ferdûbelingsnûmer fan 'e populaasje matich fermindere, wylst de krêft by alle doses behâlden waard (figuer 4A). Derneist resultearre behanneling fan eksogene MNA yn in tanimming fan it oandiel fan CD4 + en CD8 + T-sellen dy't tumornekrosefaktor-α (TNFα; figuer 4B) ekspressearje. Yn tsjinstelling, wie de intrasellulêre produksje fan IFN-γ signifikant fermindere yn CD4 + T-sellen, mar net yn CD8 + T-sellen, en wie der gjin signifikante feroaring yn interleukine 2 (IL-2; figuer 4, C en D). Dêrom liet in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fan supernatanten fan dizze MNA-behannele T-selkultueren in wichtige tanimming fan TNFα, in ôfname fan IFN-γ, en gjin feroaring yn IL-2 sjen (figuer 4, E oant G). De ôfname fan IFN-γ jout oan dat MNA in rol kin spylje by it remmen fan 'e anty-tumoraktiviteit fan T-sellen. Om it effekt fan MNA op T-sel-mediearre cytotoxiciteit te simulearjen, wurde chimere antigenreceptor T (FRα-CAR-T) sellen dy't rjochte binne op folate receptor α en CAR-T (GFP) regele troch griene fluoreszinte proteïne (GFP) -CAR-T) sellen produsearre troch sûne donor perifeare bloedmononukleêre sellen (PBMC). CAR-T-sellen waarden 24 oeren kultivearre yn 'e oanwêzigens fan MNA, en doe ko-kultivearre mei minsklike SK-OV-3 eierstoktumorsellen dy't folate receptor α ekspressearje by in effektor-oant-doelferhâlding fan 10:1. MNA-behanneling resultearre yn in wichtige ôfname yn 'e deadlike aktiviteit fan FRα-CAR-T-sellen, dy't fergelykber wie mei FRα-CAR-T-sellen behannele mei adenosine (Ofbylding 4H).
(A) Totaal oantal libbene sellen en ferdûbeling fan 'e populaasje (PD) direkt út kultuer op dei 7. De staafdiagram stiet foar it gemiddelde + SEM fan seis sûne donors. Jout gegevens fan teminsten n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten oan. (B oant D) CD3/CD28 en IL-2 waarden brûkt om T-sellen te aktivearjen by har respektive MNA-konsintraasjes foar 7 dagen. Foar de analyze waarden sellen stimulearre mei PMA/ionomycine mei GolgiStop foar 4 oeren. TNFα (B) ekspresje yn T-sellen. Foarbyldôfbylding (lofts) en tabelgegevens (rjochts) fan TNFα-ekspresje yn libbene sellen. IFN-γ (C) en IL-2 (D) ekspresje yn T-sellen. De ekspresje fan cytokines waard metten troch flowcytometry. De staafdiagram stiet foar it gemiddelde (n = 6 sûne donors) + SEM. Brûk ienrjochtingsanalyse fan fariânsje en werhelle mjittingen (*P<0.05 en **P<0.01) om de P-wearde te bepalen. Jout gegevens fan teminsten n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten oan. (E oant G) CD3/CD28 en IL-2 waarden brûkt om T-sellen te aktivearjen by har respektive MNA-konsintraasjes foar 7 dagen. It medium waard sammele foar en nei 4 oeren fan PMA/ionomycine-stimulaasje. De konsintraasjes fan TNFα (E), IFN-γ (F) en IL-2 (G) waarden metten mei ELISA. De staafdiagram stiet foar it gemiddelde (n = 5 sûne donors) + SEM. P-wearde bepaald mei ienrjochtingsfariânsje-analyze en werhelle mjittingen (*P<0.05). De stippele line jout de deteksjelimyt fan 'e deteksje oan. (H) Sellyse-assay. FRα-CAR-T- of GFP-CAR-T-sellen waarden oanpast mei adenosine (250μM) of MNA (10 mM) foar 24 oeren, of net behannele (Ctrl). It persintaazje deadzjen fan SK-OV-3-sellen waard metten. P-wearde bepaald troch Welch t-test (*P<0.5 en **P<0.01).
Om in meganistysk begryp te krijen fan MNA-ôfhinklike TNFα-ekspresjeregeling, waarden de feroaringen yn TNFα mRNA fan MNA-behannele T-sellen evaluearre (figuer 5A). Sûne donor T-sellen behannele mei MNA lieten in twafâldige tanimming sjen yn TNFα-transkripsjenivo's, wat oanjout dat MNA ôfhinklik is fan TNFα-transkripsjeregeling. Om dit mooglike regeljouwingsmeganisme te ûndersykjen, waarden twa bekende transkripsjefaktoaren dy't TNFα regelje, nammentlik aktivearre T-selnukleêre faktor (NFAT) en spesifyk proteïne 1 (Sp1), evaluearre as reaksje op MNA-binding oan 'e proksimale TNFα-promotor (30). De TNFα-promotor befettet 6 identifisearre NFAT-bindingsplakken en 2 Sp1-bindingsplakken, dy't oerlappe op ien plak [-55 basispearen (bp) fan 'e 5'cap] (30). Chromatine-immunopresipitaasje (ChIP) liet sjen dat by behanneling mei MNA, de binding fan Sp1 oan 'e TNFα-promotor trijefâldich tanommen is. De ynkorporaasje fan NFAT naam ek ta en waard hieltyd wichtiger (figuer 5B). Dizze gegevens jouwe oan dat MNA de ekspresje fan TNFα fia Sp1-transkripsje regulearret, en yn mindere mate de ekspresje fan NFAT.
(A) Yn ferliking mei T-sellen kultivearre sûnder MNA, de kearnferoaring fan TNFα-ekspresje yn T-sellen behannele mei MNA. It ekspresjepatroan mei SEM wurdt werjûn (n = 5 sûne donors). Fertsjintwurdiget gegevens fan teminsten n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. (B) De TNFα-promotor fan T-sellen behannele mei of sûnder 8 mM MNA nei't NFAT en Sp1 waarden kombineare mei (Ctrl) en PMA/ionomycine-stimulaasje foar 4 oeren. Immunoglobuline G (IgG) en H3 waarden brûkt as negative en positive kontrôles foar immunoprecipitaasje, respektivelik. De kwantifikaasje fan ChIP liet sjen dat de binding fan Sp1 en NFAT oan de TNFα-promotor yn MNA-behannele sellen ferskate kearen tanommen is yn ferliking mei de kontrôle. Fertsjintwurdiget gegevens fan teminsten n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. P-wearde bepaald troch meardere t-tests (*** P <0.01). (C) Yn ferliking mei de ascites fan HGSC, lieten T-sellen (net-cytotoxysk) ferhege ekspresje fan TNF yn 'e tumor sjen. De kleuren fertsjintwurdigje ferskate pasjinten. De werjûne sellen binne willekeurich sampled oant 300 en jitterd om overdrawing te beheinen (** Padj = 0.0076). (D) Foarsteld model fan MNA foar eierstokkanker. MNA wurdt produsearre yn tumorsellen en fibroblasten yn TME en wurdt opnommen troch T-sellen. MNA fergruttet de binding fan Sp1 oan de TNFα-promotor, wat liedt ta ferhege TNFα-transkripsje en TNFα-cytokineproduksje. MNA feroarsaket ek in ôfname fan IFN-γ. Remming fan T-selfunksje liedt ta fermindere deadzjende kapasiteit en fersnelde tumorgroei.
Neffens rapporten hat TNFα foar- en efterôfhinklike anty-tumor- en anty-tumor-effekten, mar it hat in bekende rol yn it befoarderjen fan 'e groei en metastase fan eierstokkanker (31-33). Neffens rapporten is de konsintraasje fan TNFα yn ascites en tumorweefsels by pasjinten mei eierstokkanker heger as dy yn goedaardige weefsels (34-36). Wat it meganisme oanbelanget, kin TNFα de aktivearring, funksje en proliferaasje fan wite bloedsellen regelje, en it fenotype fan kankersellen feroarje (37, 38). Yn oerienstimming mei dizze befiningen liet differinsjele genekspresje-analyze sjen dat TNF signifikant omheech regele wie yn T-sellen yn tumorweefsels yn ferliking mei ascites (figuer 5C). De tanimming fan TNF-ekspresje wie allinich dúdlik yn T-selpopulaasjes mei in net-cytotoxysk fenotype (figuer S5A). Gearfetsjend stypje dizze gegevens de opfetting dat MNA dûbele immunosuppressive en tumorbefoarderjende effekten hat yn HGSC.
Fluoreszinte labeling basearre op flowcytometry is de wichtichste metoade wurden foar it bestudearjen fan TIL-metabolisme. Dizze stúdzjes hawwe oantoand dat, yn ferliking mei perifeare bloedlymfocyten of T-sellen fan sekundêre lymfoïde organen, murine en minsklike TIL in hegere oanstriid hawwe om glukoaze op te nimmen (4, 39) en it stadige ferlies fan mitochondriale funksje (19, 40). Hoewol wy ferlykbere resultaten hawwe waarnommen yn dizze stúdzje, is de wichtichste ûntwikkeling it fergelykjen fan it metabolisme fan tumorsellen en TIL fan itselde resekteare tumorweefsel. Yn oerienstimming mei guon fan dizze eardere rapporten hawwe tumor (CD45-EpCAM +) sellen fan ascites en tumors in hegere glukoazeopname as CD8 + en CD4 + T-sellen, wat stipet dat de hege glukoazeopname fan tumorsellen kin wurde fergelike mei T-sellen. It konsept fan T-selkompetysje. TME. De mitochondriale aktiviteit fan tumorsellen is lykwols heger as dy fan CD8 + T-sellen, mar de mitochondriale aktiviteit is fergelykber mei dy fan CD4 + T-sellen. Dizze resultaten fersterkje it opkommende tema dat oksidatyf metabolisme wichtich is foar tumorsellen (41, 42). Se suggerearje ek dat CD8+ T-sellen gefoeliger kinne wêze foar oksidative dysfunksje as CD4+ T-sellen, of dat CD4+ T-sellen oare koalstofboarnen as glukoaze brûke kinne om mitochondriale aktiviteit te behâlden (43, 44). It moat opmurken wurde dat wy gjin ferskil yn glukoaze-opname of mitochondriale aktiviteit waarnommen hawwe tusken CD4+ T-effektoren, T-effektorûnthâld en T-sintraal ûnthâldsellen yn ascites. Op deselde wize hat de differinsjaasjestatus fan CD8+ T-sellen yn tumors neat te krijen mei feroaringen yn glukoaze-opname, wat it wichtige ferskil tusken T-sellen kultivearre yn vitro en minsklike TIL yn vivo markearret (22). Dizze waarnimmings waarden ek befêstige troch it gebrûk fan ûnpartidige automatyske selpopulaasje-allokaasje, wat fierder oantoande dat CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ sellen mei hegere glukoaze-opname en mitochondriale aktiviteit as tumorsellen foarkommend binne, mar in metabolike aktive selpopulaasje hawwe. Dizze populaasje kin de fertochte subpopulaasje fan myeloïde suppressorsellen of plasmacytoïde dendrityske sellen fertsjintwurdigje dy't identifisearre binne yn 'e scRNA-seq-analyze. Hoewol beide rapportearre binne yn minsklike eierstoktumoren [45], is fierder wurk nedich om dizze myeloïde subpopulaasje te beskriuwen.
Hoewol metoaden basearre op streamcytometry de algemiene ferskillen yn glukoaze- en oksidatyf metabolisme tusken seltypen dúdlik meitsje kinne, binne de krekte metaboliten produsearre troch glukoaze of oare koalstofboarnen foar mitochondriale metabolisme yn TME noch net bepaald. It tawizen fan 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan metaboliten oan in bepaalde TIL-subset fereasket suvering fan 'e selpopulaasje út it útsniene weefsel. Dêrom kin ús selferrikingsmetoade yn kombinaasje mei massaspektrometry ynsjoch jaan yn 'e metaboliten dy't ferskillend ferrike binne yn T-sellen en tumorselpopulaasjes yn oerienkommende pasjintmonsters. Hoewol dizze metoade foardielen hat boppe fluoreszinsje-aktivearre selsortering, kinne bepaalde metabolietbibleteken beynfloede wurde fanwegen ynherinte stabiliteit en/of rappe omsetsnelheid (22). Nettsjinsteande koe ús metoade twa erkende immunosuppressive metaboliten identifisearje, adenosine en kynurenine, om't se sterk ferskille tusken sampletypen.
Us metabonomyske analyze fan tumors en TIL-subtypen jout mear ynsjoch yn 'e rol fan metaboliten yn ovarium TME. Earst hawwe wy mei help fan flowcytometry bepaald dat der gjin ferskil wie yn mitochondriale aktiviteit tusken tumors en CD4 + T-sellen. LC-MS / MS-analyze liet lykwols wichtige feroarings sjen yn 'e oerfloed fan metaboliten ûnder dizze populaasjes, wat oanjout dat konklúzjes oer TIL-metabolisme en syn algemiene metabolike aktiviteit soarchfâldige ynterpretaasje fereaskje. Twadder is MNA de metaboliet mei it grutste ferskil tusken CD45-sellen en T-sellen yn ascites, net yn tumors. Dêrom kinne kompartmentalisaasje en tumorlokaasje ferskillende effekten hawwe op TIL-metabolisme, wat de mooglike heterogeniteit yn in bepaalde mikro-omjouwing markearret. Tredde, de ekspresje fan it MNA-produsearjende enzyme NNMT is benammen beheind ta CAF, dat yn mindere mate tumorsellen binne, mar detektearbere MNA-nivo's wurde waarnommen yn tumor-ôflaatte T-sellen. De oerekspresje fan NNMT yn ovarium CAF hat in bekend kankerbefoarderjend effekt, foar in part troch de promoasje fan CAF-metabolisme, tumorynvaazje en metastase (27). Hoewol it algemiene nivo fan TIL matich is, is de ekspresje fan NNMT yn CAF nau besibbe oan it mesenchymale subtype fan 'e Cancer Genome Atlas (TCGA), dat assosjeare wurdt mei in minne prognose (27, 46, 47). Uteinlik is de ekspresje fan it enzyme AOX1 dat ferantwurdlik is foar MNA-ôfbraak ek beheind ta de CAF-populaasje, wat oanjout dat T-sellen it fermogen misse om MNA te metabolisearjen. Dizze resultaten stypje it idee dat hoewol fierder wurk nedich is om dizze fynst te ferifiearjen, hege nivo's fan MNA yn T-sellen de oanwêzigens fan in ymmúnsuppressive CAF-mikroomjouwing kinne oanjaan.
Mei it each op it lege ekspresjenivo fan MNA-transporters en de ûnopspoarbere nivo's fan wichtige proteïnen dy't belutsen binne by MNA-metabolisme, is de oanwêzigens fan MNA yn T-sellen ûnferwachts. Noch NNMT noch AOX1 koene wurde ûntdutsen troch scRNA-seq-analyze en rjochte qPCR fan twa ûnôfhinklike kohorten. Dizze resultaten jouwe oan dat MNA net synthetisearre wurdt troch T-sellen, mar opnommen wurdt út omlizzende TME. In vitro-eksperiminten litte sjen dat T-sellen de neiging hawwe om eksogene MNA te sammeljen.
Us in vitro-stúdzjes hawwe oantoand dat eksogene MNA de ekspresje fan TNFα yn T-sellen ynducearret en de binding fan Sp1 oan 'e TNFα-promotor fersterket. Hoewol TNFα sawol anty-tumor- as anty-tumorfunksjes hat, kin TNFα by eierstokkanker de groei fan eierstokkanker befoarderje (31-33). De neutralisaasje fan TNFα yn eierstoktumorselkultuer of de eliminaasje fan it TNFα-sinjaal yn mûsmodellen kin de produksje fan TNFα-mediatearre inflammatoire cytokines ferbetterje en tumorgroei remme (32, 35). Dêrom kin TME-ôflaat MNA yn dit gefal fungearje as in pro-inflammatoire metaboliet fia in TNFα-ôfhinklik meganisme fia de autokrine lus, wêrtroch it foarkommen en de fersprieding fan eierstokkanker befoarderet (31). Op basis fan dizze mooglikheid wurdt TNFα-blokkade bestudearre as in potinsjeel terapeutysk middel foar eierstokkanker (37, 48, 49). Derneist ferminderet MNA de cytotoxiciteit fan CAR-T-sellen foar eierstoktumorsellen, wat fierder bewiis leveret foar MNA-mediatearre ymmúnsuppresje. Kollektyf suggerearje dizze resultaten in model wêryn tumors en CAF-sellen MNA útskiede yn ekstrasellulêre TME. Troch (i) TNF-induzearre stimulearring fan eierstokkankergroei en (ii) MNA-induzearre ynhibysje fan cytotoksyske aktiviteit fan T-sellen, kin dit in dûbeld tumoreffekt hawwe (figuer 5D).
Konklúzjend, troch in kombinaasje fan rappe selferriking, iensellige sekwinsjering en metabolike profilering ta te passen, hat dizze stúdzje de enoarme immunometabolomyske ferskillen tusken tumors en ascitesellen by HGSC-pasjinten oantoand. Dizze wiidweidige analyze liet sjen dat der ferskillen binne yn glukoseopname en mitochondriale aktiviteit tusken T-sellen, en identifisearre MNA as in net-sel autonome ymmúnregulearjende metaboliet. Dizze gegevens hawwe ynfloed op hoe't TME it T-selmetabolisme yn minsklike kankers beynfloedet. Hoewol de direkte konkurrinsje om fiedingsstoffen tusken T-sellen en kankersellen is rapportearre, kinne metaboliten ek fungearje as yndirekte regulators om tumorprogresje te befoarderjen en mooglik endogene ymmúnreaksjes te ûnderdrukken. De fierdere beskriuwing fan 'e funksjonele rol fan dizze regulatoryske metaboliten kin alternative strategyen iepenje foar it ferbetterjen fan 'e anty-tumor ymmúnreaksje.
Pasjinteksimplaren en klinyske gegevens waarden krigen fia it BC-kankertumorweefselbewarplak, sertifisearre troch it Canadian Tissue Repository Network. Neffens it protokol goedkard troch it BC Cancer Research Ethics Committee en de Universiteit fan Britsk-Kolumbia (H07-00463), hawwe alle pasjinteksimplaren en klinyske gegevens ynformearre skriftlike tastimming krigen of formeel ôfstân nommen fan har tastimming. De samples wurde opslein yn 'e sertifisearre BioBank (BRC-00290). Detaillearre pasjintkarakteristiken wurde werjûn yn tabellen S1 en S5. Foar kryopreservaasje wurdt in skalpel brûkt om it tumormonster fan 'e pasjint meganysk te ûntbinen en it dan troch in filter fan 100 mikron te drukken om in iensellige suspensje te krijen. De ascites fan 'e pasjint waard 10 minuten sintrifugearre by 1500 rpm by 4 °C om de sellen te pelletearjen en it supernatant te ferwiderjen. Sellen dy't krigen waarden fan tumor en ascites waarden kryopreservearre yn 50% waarmte-ynaktivearre minsklik AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) en 10% dimethylsulfoksyde. Dizze bewarre iensellige suspensjes waarden ûntdooid en brûkt foar metabolomika en metabolietbepaling lykas hjirûnder beskreaun.
It folsleine medium bestiet út 0,22 μm filtere 50:50 oanfolle mei RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) oanfolle mei 10% waarmte-inaktivearre minsklik AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicilline Streptomycine (PenStrep) oplossing (Thermo Fisher Scientific) en 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) wurdt oanfolle mei 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) en 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). De flowcytometer kleurbuffer bestie út 0,22 μm filtere fosfaatbufferde sâltwetter (PBS; Invitrogen) oanfolle mei 3% waarmte-inaktivearre AB minsklik serum (Sigma). De selferrikingsbuffer bestiet út 0,22 μm filtere PBS en oanfolle mei 0,5% waarmte-inaktivearre minsklik AB-serum (Sigma-Aldrich).
Yn in folslein medium fan 37 °C waarden sellen 30 minuten kleurd mei 10 nM MT DR en 100 μM 2-NBDG. Dêrnei waarden de sellen 15 minuten by 4 °C kleurd mei de libbensfetberenskleurstof eF506. Resuspendearje de sellen yn FC Block (eBioscience) en Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), verdunne se yn flowcytometer-kleurbuffer (neffens de ynstruksjes fan de fabrikant) en ynkubearje se 10 minuten by keamertemperatuer. Kleurje de sellen mei in set antistoffen (Tabel S2) yn flowcytometrie-kleurbuffer by 4 °C foar 20 minuten. Resuspendearje de sellen yn flowcytometrie-kleurbuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfiguraasje) foar de analyze. Brûk SpectroFlo en FlowJo V10 om seltellinggegevens te analysearjen, en brûk GraphPad Prism 8 om de gegevens te meitsjen. De mediane fluoreszinsje-yntensiteit (MFI) fan 2-NBDG en MT DR waard log-normalisearre, en doe waard in paired t-test brûkt foar statistyske analyze om rekken te hâlden mei oerienkommende pasjinten. Ferwiderje alle populaasjes mei minder as 40 eveneminten út 'e analyze; fier in MFI-wearde fan 1 yn foar alle negative wearden foardat jo statistyske analyze en gegevensvisualisaasje útfiere.
Om de manuele gatingstrategy fan it boppesteande prosespaniel oan te foljen, hawwe wy de folsleine annotaasje troch de foarmbeperkingsbeam (FAUST) (21) brûkt om automatysk sellen ta te wizen oan de populaasje nei it eliminearjen fan deade sellen yn FlowJo. Wy beheare de útfier manuell om populaasjes dy't ferkeard tawiisd lykje te wêzen (kombinearjen fan PD1+ mei PD1-tumorsellen) en behâlden populaasjes gear te foegjen. Elk stekproef befettet gemiddeld mear as 2% sellen, foar in totaal fan 11 populaasjes.
Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugaasje waard brûkt om PBMC te skieden fan leukocyte-skiedingsprodukten (STEMCELL Technologies). CD8+ T-sellen waarden isolearre fan PBMC mei CD8 MicroBeads (Miltenyi) en útwreide yn folslein medium mei TransAct (Miltenyi) foar 2 wiken neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. De sellen waarden 5 dagen stean litten yn folslein medium mei IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), en doe opnij stimulearre mei TransAct. Op dei 7, neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant, waarden minsklike CD45 MicroBeads (Miltenyi) brûkt om sellen yn trije opienfolgjende rûndes te ferriken. De sellen waarden aliquotearre foar flowcytometry-analyze (lykas hjirboppe beskreaun), en ien miljoen sellen waarden trije kear aliquotearre foar LC-MS/MS-analyze. De samples waarden ferwurke troch LC-MS/MS lykas hjirûnder beskreaun. Wy skatten de ûntbrekkende metabolietwearde mei in ionnûmer fan 1.000. Elk stekproef wurdt normalisearre troch it totale ionnûmer (TIC), logaritmysk omset en automatysk normalisearre yn MetaboAnalystR foar analyse.
De ienkelselsuspensje fan elke pasjint waard ûntdooid en filtere troch in 40 μm filter yn folslein medium (lykas hjirboppe beskreaun). Neffens it protokol fan 'e fabrikant waarden trije opienfolgjende rûndes fan positive seleksje troch magnetyske kraalskieding mei MicroBeads (Miltenyi) brûkt om de samples te ferriken foar CD8+, CD4+ en CD45- sellen (op iis). Koartsein, de sellen wurde opnij suspendearre yn selferrikingsbuffer (lykas hjirboppe beskreaun) en teld. De sellen waarden ynkubearre mei minsklike CD8-kralen, minsklike CD4-kralen of minsklike CD45-kralen (Miltenyi) by 4 °C foar 15 minuten, en dan wosken mei selferrikingsbuffer. It sample wurdt troch de LS-kolom (Miltenyi) laat, en de positive en negative fraksjes wurde sammele. Om de doer te ferminderjen en de selherstelstap te maksimalisearjen, wurdt de CD8-fraksje dan brûkt foar de twadde rûnde fan CD4+ ferriking, en de CD4-fraksje wurdt brûkt foar de folgjende CD45-ferriking. Hâld de oplossing op iis tidens it skiedingsproses.
Om samples foar metabolietanalyse ta te rieden, waarden de sellen ien kear wosken mei iiskâlde sâltoplossing, en 1 ml fan 80% methanol waard tafoege oan elk sample, doe vortexed en fluch beferzen yn floeibere stikstof. De samples waarden ûnderwurpen oan trije friezen-ûntdooi-syklusen en sintrifugearre by 14.000 rpm foar 15 minuten by 4 °C. De supernatant mei de metaboliten wurdt ferdampt oant droech. De metaboliten waarden opnij oplost yn 50 μl fan 0,03% mierensoer, vortexed om te mingen, en doe sintrifugearre om pún te ferwiderjen.
Ekstrahearje metaboliten lykas hjirboppe beskreaun. Oerdrage de supernatant nei in hege prestaasjes floeistofchromatografyflesse foar metabolomika-ûndersyk. Brûk in willekeurich behannelingprotokol om elk stekproef te behanneljen mei in ferlykber oantal sellen om batcheffekten te foarkommen. Wy hawwe in kwalitative beoardieling útfierd fan globale metaboliten dy't earder publisearre binne op 'e AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Chromatografyske analyze en peak area-yntegraasje waarden útfierd mei MultiQuant ferzje 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
In iontelling fan 1000 waard brûkt om de ûntbrekkende metabolietwearde te skatten, en de TIC fan elk stekproef waard brûkt om it normalisearre peakgebiet fan elke detektearre metaboliet te berekkenjen om te korrigearjen foar feroaringen dy't yntrodusearre waarden troch de ynstrumintale analyze fan stekproefferwurking. Nei't de TIC normalisearre is, wurdt MetaboAnalystR(51) (standertparameter) brûkt foar logaritmyske konverzje en automatyske normline-skalering. Wy brûkten PCA mei vegan R-pakket om ferkennende analyze út te fieren fan metaboloomferskillen tusken stekproeftypen, en brûkten partielle redundânsje-analyze om pasjinten te analysearjen. Brûk de Ward-metoade om in waarmtekaart-dendrogram te konstruearjen om de Euklidyske ôfstân tusken stekproeven te klusterjen. Wy brûkten limma (52) op standerdisearre metaboliet-oerfloed om ferskillend oerfloedige metaboliten te identifisearjen oer it heule seltype en mikro-omjouwing. Om de útlis te ferienfâldigjen, brûke wy de groepsgemiddelde parameter om it model te spesifisearjen, en beskôgje de seltypen yn 'e mikro-omjouwing as elke groep (n = 6 groepen); Foar de betsjuttingstest hawwe wy trije werhelle mjittingen útfierd foar elke metaboliet. Om falske replikaasje te foarkommen, waard de pasjint opnommen as in obstakel yn it limma-ûntwerp. Om de ferskillen yn metaboliten tusken ferskate pasjinten te kontrolearjen, hawwe wy it limma-model oanpast, ynklusyf pasjinten op in fêste manier. Wy rapportearje de betsjutting fan it foarôf oantsjutte kontrast tusken it seltype en de mikroomjouwing fan Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg-korreksje).
Nei krêftferriking mei de Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% libbensfetberens), waard transkriptoomsekwinsjearring fan ien sel útfierd op 'e totale libbene beferzen ascites- en tumormonsters mei in 10x 5'-genekspresjeprotokol. Fiif gefallen mei oerienkommende tumors en ascites waarden analysearre, hoewol de lege libbensfetberens fan ien tumormonster de opname derfan foarkaam. Om meardere seleksjes fan pasjinten te berikken, hawwe wy de samples fan elke pasjint kombineare yn 'e banen fan' e 10x chromium-controller, en de ascites- en tumorplakken apart analysearre. Nei sekwinsjearring [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired end (PE), Quebec-genoom; in gemiddelde fan 73.488 en 41.378 lêzingen per sel foar respektivelik tumor en ascites]], brûkten wy CellSNP en Vireo (53) (basearre op CellSNP as De mienskiplike minsklike SNP (VCF) levere troch GRCh38 krijt in donoridentiteit tawiisd. Wy brûke SNPRelate om de tichtste identiteit (IBS) fan 'e genotypestatus (IBS) fan' e pasjint ôf te lieden, útsein net-tawiisde sellen en sellen identifisearre as duplexen en oerienkommende donors tusken ascites- en tumormonsters (54). Op basis fan dizze taak hawwe wy trije gefallen mei in oerfloedige selrepresentaasje yn 'e tumor en ascites bewarre foar downstream-analyze. Nei it útfieren fan in massafiltraasjestap yn 'e scater (55) en scran (56) BioConductor-ferpakking, levere dit 6975 sellen (2792 en 4183 sellen fan tumor en ascites, respektivelik) op foar analyze. Wy brûke igraph's (57) Louvain-klustering fan dielde tichtste neistnetwurk (SNN) basearre op Jaccard-ôfstân ta klustersellen troch ekspresje. De Klusters waarden mei de hân annotearre oan fertochte seltypen basearre op markergenekspresje en visualisearre mei t-SNE. Cytotoksyske T-sellen wurde definieare troch de ekspresje fan CD8A en GZMA, útsein subklusters mei lege ribosomale proteïne-ekspresje. Wy hawwe tagong krigen ta de publisearre gegevens fan Izar et al. (16), ynklusyf har t-SNE-ynbêding, dy't de ekspresje-oerlaap tusken ymmúnselmarkers en NNMT-ekspresje kin kontrolearje.
PBMC waarden skieden fan leukocyte-skiedingsprodukten (STEMCELL Technologies) troch Ficoll gradiëntdichtheidsintrifugaasje. CD3+ sellen waarden isolearre fan PBMC mei CD3-kralen (Miltenyi). Yn oanwêzigens of ôfwêzigens fan MNA waarden CD3+ sellen aktivearre mei plaatbûn CD3 (5μg/ml), oplosbere CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Op de lêste dei fan útwreiding waarden de leefberens (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) en proliferaasje (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) evaluearre troch flowcytometry. Evaluearje de effektorfunksje troch sellen te stimulearjen mei PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1μg/ml) mei GolgiStop foar 4 oeren, en kontrolearje CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) en TNFα-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (MAb11, BD). Stimulearje qPCR- en ChIP-sellen mei PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1μg/ml) foar 4 oeren. De ELISA-supernatant waard sammele foar en nei stimulearring mei PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1 μg/ml) foar 4 oeren.
Folgje it protokol fan 'e fabrikant om RNA te isolearjen mei de RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Brûk QIAshredder (QIAGEN) om it stekproef te homogenisearjen. Brûk in RNA-oant-cDNA-kit mei hege kapasiteit (Thermo Fisher Scientific) om komplementêr DNA (cDNA) te synthetisearjen. Brûk TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) om genekspresje te kwantifisearjen (neffens it protokol fan 'e fabrikant) mei de folgjende probes: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-fosfaat út wetterstof (GAPDH)] en Hs01010726_m1 (SLC22A2). De samples waarden útfierd op it StepOnePlus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) yn 'e MicroAmp snelle optyske 96-well reaksjeplaat (Applied Biosystems) mei MicroAmp optyske film. Elke Ct-wearde dy't 35 grutter is, wurdt beskôge as boppe de deteksjedrompel en wurdt markearre as net-detektearber.
Fier ChIP út lykas earder beskreaun (58). Koartsein, de sellen waarden behannele mei formaldehyde (eindkonsintraasje 1,42%) en 10 minuten by keamertemperatuer ynkubearre. Brûk oanfolle swellbuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl en 0,1% NP-40) op iis foar 10 minuten, en resuspendearje dan yn immunopresipitaasjebuffer lykas beskreaun (58). It monster waard doe sonisearre mei de folgjende syklusen: 10 syklusen (20 pulsen fan 1 sekonde) en in statyske tiid fan 40 sekonden. Ynkubearje ChIP-klasse immunoglobuline G (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) en SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antistoffen mei it monster by 4°CC en skodzje oernachtich. Ynkubearje proteïne A-kralen (Thermo Fisher Scientific) mei it stekproef by 4 °C mei sêft skodzjen foar 1 oere, brûk dan chelex-kralen (Bio-Rad) om it DNA te ferriken, en brûk proteinase K (Thermo Fisher) foar proteïne-spiisfertarring. De TNFα-promotor waard ûntdutsen troch PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; krekt oarsom, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt fan 207 bp). De ôfbyldings waarden produsearre troch Image Lab (Bio-Rad) en kwantifisearre mei ImageJ-software.
De selkultuersupernatant waard sammele lykas hjirboppe beskreaun. De bepaling waard útfierd neffens de prosedueres fan 'e fabrikant fan' e minsklike TNFα ELISA-kit (Invitrogen), minsklike IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) en minsklike IFN-γ ELISA-kit (Abcam). Neffens it protokol fan 'e fabrikant waard de supernatant 1:100 ferdund om TNFα en IL-2 te detektearjen, en 1:3 om IFN-γ te detektearjen. Brûk EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) om de absorbânsje te mjitten by 450 nm.
PBMC waarden skieden fan leukocyte-skiedingsprodukten (STEMCELL Technologies) troch Ficoll gradiëntdichtheidsintrifugaasje. CD3+ sellen waarden isolearre fan PBMC mei CD3-kralen (Miltenyi). Yn oanwêzigens of ôfwêzigens fan MNA waarden CD3+ sellen aktivearre mei plaatbûn CD3 (5μg/ml), oplosbere CD28 (3μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin) foar 3 dagen. Nei 3 dagen waarden de sellen sammele en wosken mei 0,9% sâltwetter, en de pellet waard fluch beferzen. Seltelling waard útfierd troch flowcytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguraasje) mei 123count eBeads.
Ekstrahearje metaboliten lykas hjirboppe beskreaun. It droege ekstrakt waard rekonstrueare by in konsintraasje fan 4000 sel-ekwivalenten/μl. Analysearje it stekproef troch omkearde-faze chromatografy (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en CORTECS T3 kolom (2.1 × 150 mm, dieltsjegrutte 1.6-μm, poarjegrutte 120-Å; #186008500, Waters). Poalmassaspektrometer (6470, Agilent), wêryn elektrospray-ionisaasje yn positive modus wurket. Mobiele faze A is 0.1% mierensoer (yn H2O), mobile faze B is 90% acetonitril, 0.1% mierensoer. De LC-gradiënt is 0 oant 2 minuten foar 100% A, 2 oant 7,1 minuten foar 99% B, en 7,1 oant 8 minuten foar 99% B. Bring dan de kolom opnij yn lykwicht mei mobile faze A by in streamsnelheid fan 0,6 ml/min foar 3 minuten. De streamsnelheid is 0,4 ml/min, en de kolomkeamer wurdt ferwaarme oant 50 °C. Brûk de suvere gemyske standert fan MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) om de retinsjetiid (RT) en transformaasje fêst te stellen (RT = 0,882 minuten, transformaasje 1 = 137→94,1, transformaasje 2 = 137→92, Konverzje 3 = 137→78). As alle trije oergongen plakfine by de juste retinsjetiid, wurdt oergong 1 brûkt foar kwantifikaasje om spesifisiteit te garandearjen. De standertkromme fan MNA (Toronto Research Chemical Company) waard generearre troch seis seriële ferdunningen fan 'e stockoplossing (1 mg/ml) om standerts te krijen fan 0.1, 1.0, 10 en 100 ng/ml en respektivelik 1.0 en 10μg/ml floeistof. De deteksjelimyt is 1 ng/ml, en de lineêre respons leit tusken 10 ng/ml en 10μg/ml. Elke ynjeksje fan twa mikroliter fan sample en standert wurdt brûkt foar LC/MS-analyze, en in mingde kwaliteitskontrôle-sample wurdt elke acht ynjeksjes útfierd om de stabiliteit fan it analyseplatfoarm te garandearjen. De MNA-responsen fan alle MNA-behannele selmonsters wiene binnen it lineêre berik fan 'e assay. Data-analyze waard dien mei MassHunter kwantitative analysesoftware (v9.0, Agilent).
De twadde generaasje αFR-CAR-konstrukt waard oernommen fan Song et al. (59). Koartsein befettet de konstrukt de folgjende ynhâld: CD8a-liedersekwinsje, minsklik αFR-spesifyk ienkettige fariabele fragmint, CD8a-skarnier- en transmembraanregio, CD27-yntrasellulêr domein en CD3z-yntrasellulêr domein. De folsleine CAR-sekwinsje waard synthetisearre troch GenScript, en doe kloond yn 'e twadde generaasje lentivirale ekspresjevektor stroomop fan' e GFP-ekspresjekassette dy't brûkt waard om de transduksje-effisjinsje te evaluearjen.
Lentivirus wurdt produsearre troch transfeksje fan HEK293T-sellen [American Type Culture Collection (ATCC); groeid yn Dulbecco's modifisearre Eagle-medium mei 10% fetaal bovine serum (FBS) en 1% PenStrep, en brûkt CAR-GFP-fektor en De ferpakkingsplasmiden (psPAX2 en pMD2.G, Addgene) brûke lipofeksjeamine (Sigma-Aldrich). De firusbefettende supernatant waard 48 en 72 oeren nei transfeksje sammele, filtere en konsintrearre troch ultrasentrifugaasje. Bewarje de konsintrearre firale supernatant by -80 °C oant transduksje.
PBMC wurde skieden fan sûne donor-leukocyte-skiedingsprodukten (STEMCELL Technologies) troch Ficoll-gradiëntdichtheidsintrifugaasje. Brûk positive seleksje CD8-mikrokralen (Miltenyi) om CD8+ sellen te isolearjen fan PBMC. Stimulearje T-sellen mei TransAct (Miltenyi) en yn TexMACS-medium [Miltenyi; oanfolle mei 3% waarmte-inaktivearre minsklik serum, 1% PenStrep en IL-2 (300 U/ml)]. Fjouwerentweintich oeren nei stimulearring waarden T-sellen transdusearre mei lentivirus (10 μl konsintrearre firussupernatant per 106 sellen). 1 oant 3 dagen nei transduksje op Cytek Aurora (op FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluearje de GFP-ekspresje fan 'e sellen om in transduksje-effisjinsje fan teminsten 30% oan te toanen.
CAR-T-sellen waarden 24 oeren kultivearre yn Immunocult (STEMCELL Technologies; oanfolle mei 1% PenStrep) ûnder de folgjende omstannichheden: net behannele, behannele mei 250 μM adenosine of 10 mM MNA. Nei foarbehanneling waarden CAR-T-sellen wosken mei PBS en kombinearre mei 20.000 SK-OV-3-sellen [ATCC; yn McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) oanfolle mei 10% FBS en 1% PenStrep op 10: De effektor-doelferhâlding fan 1 waard yn triplikaat amplifisearre yn oanfolle Immunocult-medium. SK-OV-3-sellen en SK-OV-3-sellen lysearre mei digitalis-saponine (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) waarden brûkt as negative en positive kontrôles, respektivelik. Nei 24 oeren fan ko-kultivaasje waard de supernatant sammele en waard de laktaatdehydrogenase (LDH) metten neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). De LDH-supernatant waard 1:50 ferdund yn LDH-buffer. It persintaazje deadzjen waard metten mei de folgjende formule: persintaazje deadzjen = persintaazje korreksje / maksimale deadzjetaryf x 100%, wêrby't persintaazje korreksje = ko-kultuer-allinich T-sellen, en maksimale deadzjetaryf = positive kontrôle-negative kontrôle.
Lykas beskreaun yn 'e tekst of materialen en metoaden, brûk GraphPad Prism 8, Microsoft Excel of R v3.6.0 foar statistyske analyze. As meardere stekproeven wurde sammele fan deselde pasjint (lykas ascites en tumor), brûke wy in pear t-test of nimme wy de pasjint op as in willekeurich effekt yn in lineêr of generalisearre model as passend. Foar metabolomika-analyze wurdt de belangstest yn triplikaat útfierd.
Foar oanfoljende materialen foar dit artikel, sjoch http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dit is in iepen tagongsartikel ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, dy't it gebrûk, de distribúsje en de reproduksje yn elk medium tastiet, salang't it definitive gebrûk net foar kommersjeel gewin is en it útgongspunt is dat it orizjinele wurk korrekt is. Referinsje.
Opmerking: Wy freegje jo allinich om jo e-mailadres op te jaan, sadat de persoan dy't jo oanbefelje oan 'e pagina wit dat jo wolle dat se de e-mail sjogge en dat it gjin spam is. Wy sille gjin e-mailadressen fêstlizze.
Dizze fraach wurdt brûkt om te testen oft jo in besiker binne en automatyske spamferstjoering te foarkommen.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralphini J.), Russell G. DeB. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draacht by oan 'e ymmúnsuppresje fan T-sellen en fertsjintwurdiget in potinsjeel immunoterapy-doelwit foar de behanneling fan minsklike kanker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralphini J.), Russell G. DeB. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draacht by oan 'e ymmúnsuppresje fan T-sellen en fertsjintwurdiget in potinsjeel immunoterapy-doelwit foar de behanneling fan minsklike kanker.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rjochten foarbehâlden. AAAS is in partner fan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.