Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy jo in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Oars as by wringedieren wurdt der algemien tocht dat ynsekten gjin manlik-foaroardielde geslachtssteroïdehormonen hawwe. Yn Anopheles gambiae liket de ecdysonsteroïde 20-hydroxyecdyson (20E) evoluearre te wêzen om aai-ûntwikkeling te kontrolearjen as se troch wyfkes synthetisearre wurde2 en om in paringsrefraktêre perioade te indusearjen as se seksueel oerdroegen wurde troch mantsjes3. Om't aai-ûntwikkeling en paring essensjele reproduktive eigenskippen binne, kin it begripen fan hoe't froulike Anopheles-muggen dizze hormonale sinjalen yntegrearje it ûntwerp fan nije malariakontrôleprogramma's fasilitearje. Hjir litte wy sjen dat dizze reproduktive funksjes wurde regele troch ûnderskate geslachtssteroïden fia in kompleks netwurk fan ecdysteroïde-aktivearjende/inaktivearjende enzymen. Wy hawwe in manlik-spesifike oksidearre ecdyson, 3-dehydro-20E (3D20E), identifisearre, dy't de âlderskip beskermet troch de seksuele ûntfanklikens fan froulju te ûnderbrekken nei seksuele oerdracht en aktivearring troch defosforylaasje. It is opmerklik dat 3D20E-oerdracht ek de ekspresje feroarsake fan reproduktive genen dy't de aai-ûntwikkeling behâlde tidens Plasmodium-ynfeksje, wêrtroch't de sûnens fan ynfekteare wyfkes garandearre wurdt. Fan wyfkes ôflaat 20E wekket gjin seksuele reaksje op, mar lit parende yndividuen aaien lizze neidat 20E-remmende kinasen binne ynhibearre. De identifikaasje fan dit manlik-spesifike ynsektensteroïdehormoan en syn rol yn it regeljen fan froulike seksuele ûntfanklikens, fruchtberens en ynteraksje mei Plasmodium suggerearret de potinsje om it reproduktive súkses fan malaria-oerdraachjende muggen te ferminderjen.
Malariagefallen en deaden nimme wer ta4 fanwegen wiidfersprate ynsektizidresistinsje by Anopheles-muggen, de ienige fektor fan minsklike malariaparasiten. De paringsbiology fan dizze muggen is in bysûnder oantreklik doelwyt foar nije malariakontrôle-yntervinsjes, om't wyfkes mar ien kear pare5; it steryl meitsjen fan dizze ienige paringsgebeurtenis soe in grut potinsjeel hawwe om muggepopulaasjes yn it fjild te ferminderjen.
Froulju reitsje seksueel ûnbekwaam nei't se hege-titer steroidehormonen fan manlju krigen hawwe. Undersyk hat oantoand dat de trigger foar swierrichheden by fierdere paring 20-hydroxyecdysone (20E) is, in steroidehormoan better bekend as in regulator fan 'e fervelingssyklus yn it larvale stadium. It fermogen fan mantsjes om 20E te synthetisearjen en oer te dragen is spesifyk evoluearre yn Anopheles-soarten dy't diel útmeitsje fan it subgenus Cellia7, dat ferspraat is yn Afrika en de gefaarlikste fektoren fan malaria omfettet, ynklusyf Anopheles gambiae. Dit is foaral opmerklik, om't by dizze soarten wyfkes ek 20E produsearje nei elke bloedmiel, en 20E de oogenesesyklus oandriuwt (sjoch ref. 8). Der is lykwols net folle bekend oer de manier wêrop wyfkes sinjalen yntegrearje fan twa ferskillende boarnen fan ecdysone (manlike oerdracht en bloedfiedingsynduksje) sûnder har eigen fermogen om te paren yn gefaar te bringen. Eins, as de 20E produsearre troch de wyfkes seksuele yntolerânsje triggert, sil dit liede ta ûnfruchtberens by yndividuen dy't jongfaam fiede, in heul gewoan gedrach by dizze muggen5.
In mooglike ferklearring is dat A. gambiae-mantsjes in modifisearre manlik-spesifike ecdysone oerdrage, dy't in sinjaalkaskade yn it froulike fuortplantingskanaal aktivearret, wat resulteart yn paringsynstabiliteit. Hoewol vertebraten meardere steroïdehormonen hawwe, lykas oestrogeen en androgen (besjoen yn ref. 9), binne foar safier't wy witte, androgene-biasearre steroïden net identifisearre yn ynsekten.
Wy hawwe ús ynset om it repertoire fan steroidehormonen yn 'e manlike accessoireklier (MAG) fan seksueel folwoeksen A. gambiae te bepalen op syk nei mooglike modifisearjende steroiden. Mei help fan hege prestaasjes floeistofchromatografy keppele oan tandemmassaspektrometry (HPLC-MS/MS) ynstee fan 'e minder spesifike metoade dy't earder brûkt waard, hawwe wy ecdyson (E) en 20E yn dit weefsel ûntdutsen, wat it eardere resultaat befêstiget. It stekproef waard lykwols dominearre troch oksidearre fosforylearre steroiden, yn oerienstimming mei de formule 3-dehydro-20E-22-fosfaat (3D20E22P)12 (figuer 1). Oare foarmen omfetsje 3-dehydro-20E (3D20E) en 20E-22-fosfaat (20E22P). De HPLC-MS/MS-sinjaalintensiteit fan 3D20E22P wie twa oarders fan grutte heger as syn defosforylearre foarm, 3D20E, en trije oarders fan grutte heger as dy fan E en 20E (figuer 1). Hoewol yn oare dielen fan it lichem en de legere fuortplantingskanaal (LRT; Útwreide gegevens Fig. 1a). Wy analysearren ek ekdysteroïden yn nij sletten (<1 dei âlde) mantsjes en wyfkes en detektearren allinich 3D20E en 3D20E22P yn MAG; E, 20E en 20E22P wiene oanwêzich yn beide geslachten (Útwreide gegevens Fig. 1b). Dizze gegevens suggerearje dat folwoeksen mantsjes fan A. gambiae hege titers fan modifisearjende hormonen produsearje yn har MAG's dy't net synthetisearre wurde troch wyfkes.
MAG en froulike LRT (ynklusyf atria, seminale vesikels en parovarium) waarden dissekearre fan 4 dagen âlde (4 dagen âlde) jongfaam mantsjes en jongfaam en pearde wyfkes (0.5, 3 en 12 hpm). Ecdysone yn dizze weefsels waard analysearre troch HPLC-MS/MS (gemiddelde ± sem; ûnpare t-test, twasidich, falske ûntdekkingsrate (FDR) korrizjearre; NS, net signifikant; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 oeren vs. 0.5 oeren, P = 0.035; 12 oeren vs. 3 oeren, P = 0.0015; 12 oeren vs. 0.5 oeren, P = 0.030. 3D20E22P: 3 oeren vs. 0.5 oeren, P = 0.25; 12 oeren vs. 3 oeren, P = 0.0032; 12 oeren vs. 0.5 oeren, P = 0.015). Gegevens binne fan trije biologyske replikaten. It piekgebiet foar elke ecdysone fan belang waard berekkene en normalisearre troch it oantal muggen. Ecdysone wurdt as folget troch kleur fertsjintwurdige: E, grien; 20E, oranje; 20E22P, pears; 3D20E, blau; 3D20E22P, rôze. De ynfoegsel fergruttet de skaal op 'e y-as om legere ecdysonenivo's te sjen litten.
Om te ûndersykjen oft 3D20E22P en 3D20E oerdroegen wurde tidens de paring, hawwe wy froulike LRT's op ferskate tiidpunten nei de paring dissekearre. Hoewol ecdyson net fûn waard yn jongfammen, hawwe wy substansjele hoemannichten 3D20E22P yn 'e LRT direkt nei de paring waarnommen (0,5 oere nei de paring, hpm), dy't yn 'e rin fan' e tiid ôfnamen, wylst de 3D20E-nivo's signifikant tanommen (Fig. 1). Mei gebrûk fan gemysk synthetisearre 3D20E as standert, hawwe wy bepaald dat de nivo's fan dit steroïdehormoan yn parings-LRT's teminsten 100 kear heger wiene as 20E (Utwreide gegevenstabel 1). Sa is 3D20E22P it wichtichste manlike ecdyson dat oerdroegen wurdt nei de froulike LRT tidens de paring, en syn defosforylearre foarm, 3D20E, wurdt koart nei de paring tige oerfloedich. Dit suggerearret in wichtige rol foar de lêste ecdyson yn 'e biology fan froulike nei de paring.
Nei it generearjen fan in nije RNA-sekwinsjearringsdataset (RNA-seq) (Fig. 2a), mei in oanpaste bioinformatika-pipeline, hawwe wy socht nei ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), en ecdysone dy't kodearje foar it 20E-modifisearre fosfatase-gen. EPP) wurdt útdrukt yn reproduktive weefsels. Wy hawwe ien kandidaat-EPP-gen en twa potinsjele EcK-genen (EcK1 en EcK2) identifisearre, mar koenen gjin goed kandidaat-EO-gen fine. It is opmerklik dat yndividuele EPP-genen op hege nivo's (98,9e persintyl) útdrukt waarden yn Gambiaanske MAG's, mar net yn froulike LRT's (Fig. 2b), yn tsjinstelling ta ús ferwachtingen, om't defosforylaasje fan 3D20E22P yn dit froulike weefsel plakfûn. Dêrom leauwe wy dat manlike EPP oerdroegen wurde kin tidens de paring. Yndied, wy hawwe yn vivo stabile isotooplabeling brûkt om it froulike proteïne nei de paring te maskearjen, in enzyme identifisearre troch MS yn it froulike atrium (Fig. 2c en Oanfoljende Tabel 1). De oanwêzigens fan EPP yn MAG en pare (mar net jongfaam) froulike LRT waard ek befêstige mei spesifike antistoffen (Fig. 2d).
a, In op maat makke bioinformatika-pipeline om de reproduktive weefsels fan elk geslacht te sykjen nei genen dy't kodearje foar EcK's, EO's en EPP's. De sifers neist de pylken jouwe it oantal manlike en froulike kandidaten oan by elke stap. Dizze analyze identifisearre ien EPP-gen (EPP) en ien EcK-gen (EcK1) dy't útdrukt wurde yn mantsjes, en ien EcK-gen (EcK2) dat útdrukt wurdt yn beide geslachten, mar gjin kandidaat-EO-gen oplevert. b, Heatmap dy't kandidaat-genekspresje fergeliket yn jongfaamlike (V) en parende (M) Anopheles gambiae en Anopheles albicans weefsels. Spca, befruchting; MAG's, accessoireklieren yn mantsjes; oare dielen fan it lichem, ynklusyf boarsten, wjukken, skonken, fette lichems en ynterne organen yn beide geslachten, en eierstokken by wyfkes. EcK2 wurdt heech útdrukt yn sawol MAG as atria fan Gambia, wylst EPP allinich fûn wurdt yn MAG. c, Proteomyske analyze fan manlike ejakulaatgroep-translokaasje yn froulike atria op 3, 12 en 24 hpm, dy't de 67 meast foarkommende proteïnen sjen lit. Wyfkes waarden grutbrocht op in dieet mei 15N om alle proteïnen te labeljen (en te maskearjen). Untagged mantsjes waarden pare mei tagged wyfkes, en froulike LRT's waarden dissekearre op 3, 12 en 24 hpm foar proteomyske analyze (sjoch Oanfoljende Tabel 1 foar in folsleine list mei ejakulatoire proteïnen). Ynset, EPP, Eck1 en EcK2 waarden ûntdutsen yn 'e MAG fan jongfaam mantsjes troch proteomyske analyze fan dizze weefsels. d, EPP waard ûntdutsen troch western blot yn MAG en LRT fan pare wyfkes, mar net yn jongfaam wyfkes of mantsjes of de rest fan it froulike lichem. Membranen waarden tagelyk ûndersocht mei anti-actine (laadkontrôle) en anti-EPP-antistoffen. Alle manlju binne jongfammen. Sjoch oanfoljende figuer 1 foar gegevens fan gelboarnen. Western blots waarden twa kear útfierd mei ferlykbere resultaten.
De ecdysteroïde fosfofosfatase-aktiviteit fan EPP waard ferifiearre nei ynkubaasje troch HPLC-MS/MS mei 3D20E22P isolearre út MAG (Extended Data Fig. 2a). Fierder, doe't wy EPP stilmakken troch RNA-bemiddelde ynterferinsje (RNAi), detektearren wy in sterke fermindering fan fosfatase-aktiviteit yn 'e reproduktive weefsels fan dizze mantsjes (Fig. 3a), en wyfkes dy't pare waarden mei EPP-stilmakke mantsjes lieten in signifikant legere proporsje fan defosforylearre 3D20E sjen (Fig. 3b) nettsjinsteande partielle genstilmeitsjen (Extended Data Fig. 2b,c). Yn tsjinstelling, detektearren wy gjin wichtige feroaringen yn 'e 20E22P/20E-ferhâlding yn deselde muggen, wat derop kin wize dat it enzym spesifyk is foar 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Fermindere fosfatase-aktiviteit yn MAG feroarsake troch EPP-stilmeitsjen mei dûbelstrenge EPP RNA (dsEPP) of dûbelstrenge GFP RNA (dsGFP) kontrôles. Tweintich MAG-pools waarden brûkt yn elke replikaat (P = 0.0046, peare t-test, twasidich), fertsjintwurdige troch aparte punten. b, Wyfkes pare mei EPP-stilmakke mantsjes hienen in signifikant legere proporsje fan defosforylearre 3D20E by 3 hpm (P = 0.0043, net-pearde t-test, twasidich), wylst 20E-nivo's net beynfloede waarden (P = 0.063, net-pearde). t-test, twasidich). Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± sem fan trije pools fan 13, 16 en 19 wyfkes elk.c, Wyfkes dy't pare waarden mei EPP-stilmakke mantsjes hienen signifikant hegere tariven fan opnij paring (P = 0.0002, Fisher's krekte test, twasidich). Wyfkes waarden earst twongen om te paren om har paringsstatus te garandearjen; 2 dagen letter waarden se yn kontakt brocht mei oare mantsjes dy't transgeen sperma droegen om de paringssifers te beoardieljen troch kwantitative PCR-deteksje fan it transgen.d, Bloedfiede wyfkes dy't pare waarden mei EPP-stilmakke mantsjes hienen in signifikant fermindere fruchtberens (P < 0.0001; Mann-Whitney-test, twasidich) en in wat fermindere oantal aaien (P = 0.088, Mann-Whitney-test, twasidich), wylst it spawningssifer net beynfloede waard (P = 0.94, Fisher's krekte test, twasidich). Yn alle panielen stiet n foar it oantal biologysk ûnôfhinklike muggenmonsters.NS, net signifikant.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Folgjende hawwe wy ûndersocht oft ecdysone-defosforylaasje wichtich is foar it opwekken fan paringsresistinsje by wyfkes. It is opmerklik dat wyfkes dy't pare binne mei EPP-útputte mantsjes folle faker opnij pare hawwe (44,9%) as kontrôlewyfkes (10,4%) doe't se bleatsteld waarden oan ekstra (transgene) mantsjes (Fig. 3c). Wy hawwe ek in wichtige ôfname yn fruchtberens waarnommen (Fig. 3d, lofts) en in lichte ôfname yn it oantal aaien dat troch dizze wyfkes lein is (Fig. 3d, midden), wylst it persintaazje aaien dat troch wyfkes lein is (in oare reaksje dy't by wyfkes oproppen wurdt troch paring) net beynfloede waard (Fig. 3d, rjochts). Mei it each op de waarnommen spesifisiteit fan EPP foar 3D20E22P, suggerearje dizze resultaten dat de aktivearring fan 3D20E troch EPP dy't oerdroegen wurdt tidens de paring in wichtige rol kin spylje by it útskeakeljen fan 'e ûntfanklikens fan wyfkes foar fierdere paring, in gedrach dat earder taskreaun waard oan 'e seksuele oerdracht fan 20E. Dêrom beynfloedet dit manlik-spesifike hormoan ek sterk de fruchtberens fan froulju.
Folgjende hawwe wy de aktiviteiten fan 20E en 3D20E fergelike yn ynjeksje-eksperiminten by seksueel folwoeksen jongfammen mei gebrûk fan gemysk synthetisearre 3D20E (Fig. 4a-c) en kommersjeel beskikbere 20E. Wy hawwe waarnommen dat 3D20E signifikant effektiver wie as 20E yn it ôfsluten fan 'e gefoelichheid fan wyfkes foar paring by beide konsintraasjes (Fig. 4d). Opmerklik is dat de helte fan it fysiologyske nivo fan 3D20E yn 'e LRT (1.066 pg nei ynjeksje vs. 2.022 pg nei paring) in oandiel fan refraktêre wyfkes feroarsake dat 20 kear heger wie as it fysiologyske nivo fan 20E (361 pg nei ynjeksje) 24 oeren nei ynjeksje by de heechste konsintraasje 18 pg nei paring; Útwreide gegevenstabel 1). Dit resultaat is yn oerienstimming mei it idee dat seksuele oerdracht fan 20E gjin refraktêre perioaden foar paring feroarsaket, en wiist fierder op 3D20E as in wichtige faktor yn it garandearjen fan in âlder-bernrelaasje. 3D20E wie ek signifikant aktiver as 20E yn aai-legtests by jongfaamwyfkes (Fig. 4e), wat suggerearret dat it normale aai-legsnelheid dat wy waarnommen hawwe nei partielle EPP-stilmeitsjen te tankjen wie oan 'e oanwêzigens fan oerbleaune 3D20E-aktiviteit dy't noch produsearre waard troch paringsinduzearre froulike faktoaren.
(a,b) 3D20E gemysk synthetisearre út 20E (a) mei tige hege konverzje/effisjinsje (gegevens presintearre as gemiddelde ± sem fan trije ûnôfhinklike synteze-reaksjes) (b).c, Massaspektrum (ûnderste helte) komt krekt oerien mei ecdysone fûn yn pare froulike LRT (boppeste helte).d, Yn ferliking mei 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's eksakte test, twasidich) en 10% ethanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's eksakte test, twasidich), wylst 20E allinich signifikant heger wie as kontrôle by hegere doses (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisher's eksakte test, twasidich).e, 3D20E ynjeksje feroarsake signifikant hegere spawningsraten by jongfaamwyfkes as 10% ethanol-kontrôles (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher's eksakte test, twasidich), wylst 20E yn ferliking mei kontrôles allinnich by hegere doses (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher's eksakte test, twasidich).3D20E feroarsake signifikant hegere spawningsraten as 20E by hegere doses (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher's eksakte test, twasidich).Yn alle panielen stiet n foar it oantal biologysk ûnôfhinklike muggenmonsters.NS, net signifikant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.Gegevens binne fan trije replikaten.
Yn eardere stúdzjes hawwe wy fêststeld dat seksuele oerdracht fan steroïde hormonen de ekspresje fan MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ynducearret, in froulik reproduktyf gen dat A. gambiae-wyfkes beskermet tsjin P. falciparum-ynfeksje. Sûnenskosten feroarsake troch 13, de deadlikste minsklike malariaparasyt. Mei it each op it belang fan MISO foar de reproduktive fitness fan Anopheles yn malaria-endemyske gebieten, hawwe wy besletten om te bepalen hokker hormoan 3D20E of 20E de ekspresje fan dit gen triggeret. Wy fûnen dat, wylst 20E-ynjeksje spesifyk of krêftiger guon nukleêre hormoanreceptors (HR) ynducearre, lykas HR3 en HR4, en typyske downstream steroïde doelen, lykas de yologenyske genen Vg14, 15, 16, MISO sterker waard ynducearre troch 3D20E (Extended Data Fig. 3). Sa liket de seksuele oerdracht fan dit androgene steroïde hormone meganismen te ynducearjen dy't wyfkes beskermje tsjin de kosten dy't parasitêre ynfeksje feroarsaket. Fierder beynfloedet 3D20E ferskillend beide isoformen fan 'e E-reseptor EcR, wêrtroch EcR-A ynducearre wurdt en EcR-B ûnderdrukt wurdt, en oare paringsindusearjende genen sterker triggert, ynklusyf HPX15, dat ynfloed hat op 'e fruchtberens fan froulju. Dit koe de wichtige ûnfruchtberens ferklearje dy't waarnommen wurdt by wyfkes dy't pare binne mei EPP-stilmakke mantsjes (Utwreide gegevens Fig. 3). Dizze gegevens suggerearje it bestean fan downstream-paden dy't by foarkar aktivearre wurde troch twa ecdysonhormonen dy't mooglik ten grondslach lizze oan geslachtsspesifike funksje.
Folgjende hawwe wy de funksje fan 'e twa EcK-genen testen dy't identifisearre binne yn ús bioinformatika-pipeline. It stilmeitsjen fan EcK1 of EcK2 resultearre yn wichtige mortaliteit by manlju (Utwreide gegevens Fig. 4a), wat suggerearret dat ecdysone-fosforylaasje, en dus ynaktivaasje, wichtich is foar oerlibjen. Omdat EcK2 op hegere nivo's útdrukt waard as EcK1 en waard ûntdutsen yn MAG's troch proteomics (Fig. 2b, c en Oanfoljende tabel 2), hawwe wy syn ecdysteroïde kinase-aktiviteit validearre troch it te ynkubearjen mei 20E, wat resultearre yn fosforylaasje 20E22P (Utwreide gegevens Fig. 2).4b). By it brûken fan 3D20E as substraat koene wy ​​it fosforylearre produkt 3D20E22P net detektearje (Utwreide gegevens Fig. 4c), wat suggerearret dat 20E ynstee fan 3D20E it foarkarsdoel fan EcK2 kin wêze.
Neffens ús RNA-seq-analyze waard EcK2 ek heech útdrukt yn 'e LRT fan jongfaamwyfkes, dêr't it nei it pearjen útskeakele waard (Fig. 2b). Wy hawwe dizze gegevens befêstige en bepaald dat EcK2-ekspresje net beynfloede waard troch bloedfieding (Utwreide gegevens Fig. 5a). Troch ús earste MS-eksperiminten út te wreidzjen, hawwe wy bepaald dat de pyk fan 20E22P nau besibbe wie oan 'e pyk fan 20E (22-26 oeren nei bloedmiel; Útwreide gegevens Fig. 5b). Stillizzen fan EcK2 yn jongfaamwyfkes resultearre yn in 3-fâldige ferheging fan 'e relative ferhâlding fan 20E oant 20E22P 26 oeren nei it bloedmiel (Utwreide gegevens figueren 2c en 5c), wat befêstiget dat EcK2 ek 20E fosforylearret yn wyfkes. It is opmerklik dat EcK2-útputte jongfammen folsleine seksuele ûntfanklikens behâlden (Utwreide gegevens Fig. 5d,e), wat fierder suggerearret dat de produksje fan 20E by wyfkes gjin refraktêre perioaden foar it pearjen ynducearret. Dizze wyfkes hiene lykwols signifikant... ferhege aai-legsnelheden yn ferliking mei kontrôles, mei mear as 30% fan 'e jongfammen dy't aaien leinen (Utwreide gegevens Fig. 5f). As dûbelstrenge Eck2 RNA (dsEcK2) ynjeksjes waarden útfierd nei bloedfieding, fûn der gjin paaien plak, wêrnei't de 20E-pyk troch bloedopname ôfnaam wie. Oer it algemien stypje dizze resultaten in model dat 20E produsearre nei bloed sûgjen paaien kin feroarsaakje, mar allinich as de paaienblok (EcK2 en mooglik oare faktoaren) útskeakele wurdt troch paring. Noch 20E noch 3D20E-ynjeksjes remden EcK2-ekspresje yn jongfammen (Utwreide gegevens Fig. 5g), wat suggerearret dat oare faktoaren de ynhibysje fan dizze kinase bemiddelje. 20E-nivo's nei bloedfieding wiene lykwols net genôch om paringsûngemak te feroarsaakjen, mar waarden effektyf triggerd troch hege titers fan seksueel oerdraachbere 3D20E.
Us resultaten jouwe wichtige ynsjoggen yn 'e meganismen dy't it reproduktive súkses fan A. gambiae regelje. In model is ûntstien wêrby't mantsjes evoluearre binne om hege titers fan 3D20E te synthetisearjen, in manlik-spesifike modifisearre ecdyson dy't âlderskip garandearret troch wyfkes te desensibilisearjen foar fierdere paring. Tagelyk hawwe dizze malariafektoaren ek in effisjint systeem ûntwikkele om 3D20E by wyfkes te aktivearjen as reaksje op 'e seksuele oerdracht fan manlik-spesifike EPP. Foar safier't wy witte, is dit it earste foarbyld fan in manlik- en wyfkedominearre steroidehormoansysteem dat in unike en krityske funksje útfiert by ynsekten. Manlik-spesifike ecdysonfunksje is postulearre, mar net definityf oantoand. Bygelyks, in foar in grut part wjerleine hypoteze 18 is dat dizze funksjes útfierd wurde kinne troch de 20E-foarrinner E1. It is bekend dat yn Drosophila monandry trigger wurdt troch de seksuele oerdracht fan lytse sekspeptiden 19,20 dy't ynteraksje hawwe mei neuroanen dy't it froulike reproduktive traktaat innervearje fia spesifike sekspeptide-receptors 21,22. Fierder wurk is nedich om de downstream-sinjalearring te bepalen. kaskades kontroleare troch 3D20E yn A. gambiae-wyfkes en om te bepalen oft dizze kaskades bewarre bliuwe kinne tusken muggen en Drosophila.
Mei it each op 'e wichtige rol fan 3D20E op froulike fruchtberens en gedrach dy't yn ús stúdzje identifisearre binne, biede de paden dy't liede ta 3D20E-synteze en aktivearring nije kânsen foar takomstige strategyen foar muggenkontrôle, lykas it generearjen fan kompetitive sterile mantsjes yn sterile ynsektentechnologystrategyen. Gebrûk foar wylde frijlitting of om de 3D20E te imitearjen yn jongfaamsspul. De manlike-spesifike funksje fan 3D20E kin evoluearre wêze doe't A. gambiae en oare Cellia-soarten it fermogen krigen om har sperma te koagulearjen yn paringspluggen, om't dit de effisjinte oerdracht fan in grut oantal hormonen en hormoan-aktivearjende enzymen mooglik makket. Op syn beurt biedt 3D20E-evolúsje dy't monandry ymplementearret in meganisme foar wyfkes (troch hege ekspresje fan MISO) om har reproduktive fitness te befoarderjen yn gebieten mei hege malariaprevalinsje, wat yndirekt bydraacht oan Plasmodium-oerdracht. Mei it each op it feit dat oantoand is dat froulike 20E djipgeande effekten hat op it oerlibjen en de groei fan P. falciparum yn froulike Anopheles-muggen,24 binne sawol manlike as froulike steroïde hormoanpaden no wichtige aspekten fan muggen-parasyt-ynteraksjes.
A. gambiae G3-stammen waarden grutbrocht ûnder standert ynsektenomstannichheden (26-28 °C, 65-80% relative fochtigens, 12:12 oeren ljocht/tsjuster fotoperioade). Larven waarden fiede mei poeierfoarmich fiskfoer (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets en Tetra Pond Sticks yn in ferhâlding fan 7:7:2). Folwoeksen muggen waarden ad libitum 10% dextrose-oplossing en wykliks minsklik bloed fiede (stúdzjebloedkomponinten). Jonge muggen waarden krigen troch de geslachten te skieden yn it popstadium nei it ûndersykjen fan 'e úteinen mei mikroskopie. Mantsjes dy't it DsRed-transgen drage, binne earder beskreaun.
Twongen paringseksperiminten waarden útfierd neffens earder beskreaune protokollen. Foar natuerlike paring waarden 4 dagen âlde jongfaamwyfkes twa nachten yn in ferhâlding fan 1:3 hâlden mei seksueel folwoeksen jongfaamwyfkes. Foar eksperiminten wêrby't mantsjes ynjektearre waarden mei dsEPP, foel it ko-koaien gear mei dagen 3-4 nei ynjeksje, doe't fosfatase-aktiviteit maksimaal stil wie (Utwreide gegevens Fig. 2b).
Muggenweefsels, oerbleaune kadavers (rest fan it lichem), of it hiele lichem waarden dissekearre yn 100% metanol en homogenisearre mei in beader (2 mm glêzen kralen, 2.400 rpm, 90 sek). Weefselhoeveelheden en metanolvoluminten wiene as folget: rest fan it lichem, 50 yn 1.000 µl; MAG, 50–100 80 µl; froulike LRT, 25–50 80 µl. De delslach waard ûnderwurpen oan in twadde metanol-ekstraksje mei itselde folume metanol. Selresten waarden fuorthelle troch sintrifugaasje. De metanol fan beide ekstraksjes waard kombinearre en droege ûnder stikstofstream, en doe opnij suspendearre yn de folgjende folumes fan 80% metanol yn wetter: rest fan it lichem, 50 µl; MAG's en froulike LRT, 30 µl.
De samples waarden analysearre op in massaspektrometer (ID-X, Thermo Fisher) keppele oan in LC-ynstrumint (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl fan it sample waard ynjektearre op in kolom fan 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) dy't op 25 °C hâlden waard. De mobile fazen foar de LC wiene A (wetter, 0,1% mierensoer) en B (acetonitril, 0,1% mierensoer). De LC-gradiënt wie as folget: 5% B foar 1 minút, dan ferhege nei 100% B oer 11 minuten. Nei 8 minuten by 100%, bring de kolom wer yn lykwicht by 5% B foar 4 minuten. De streamsnelheid wie 0,3 ml min-1. Ionisaasje yn 'e MS-boarne wurdt berikt troch ferwaarme elektrospray-ionisaasje yn positive en negative modi.
De massaspektrometer mjit gegevens yn it m/z-berik fan 350 oant 680 mei in resolúsje fan 60.000 yn folsleine MS-modus. MS/MS-gegevens waarden sammele op [M + H]+ (alle doelen), [M - H2O + H]+ (alle doelen), en [M - H]- (fosforylearre doelen). MS/MS-gegevens waarden brûkt om de ecdysoneigenskippen fan doelen te befêstigjen wêrfoar gjin standert beskikber wie. Om net-rjochte ecdysteroïden te identifisearjen, waarden MS/MS-gegevens foar alle HPLC-pieken mei >15% relative oerfloed analysearre. Kwantifisearje mei standertkurven makke fan suvere standerts (20E, 3D20E) om absolute hoemannichten of ferdunningen fan ien spesifyk stekproef (alle oare doelen) te berekkenjen om har lykweardigens te berekkenjen mei de hoemannichten fûn yn ien man. Foar 3D20E waard kwantifikaasje útfierd mei de som fan 'e folgjende addukten: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Gegevens waarden ekstrahearre en kwantifisearre mei Tracefinder (ferzje 4.1). MS/MS-gegevens waarden analysearre mei Xcalibur (ferzje 4.4). De MS-spektra fan E, 20E en 3D20E waarden fergelike mei de respektive standerts. 3D20E22P waard analysearre troch derivatisaasje mei Girard's reagens. 20E22P waard analysearre troch m/z-ferhâlding.
3D20E22P waard suvere út MAG. Suvering waard útfierd op in analytyske skaal mei in ultra-prestaasjes floeistofchromatograaf (Acquity, Waters) mei in quadrupoal massa-basearre detektor (QDa, Acquity, Waters) ûnder deselde LC-omstannichheden as de HPLC-MS/MS-analyze. Fraksjekolleksje waard trigger doe't de m/z dy't oerienkomt mei 3D20E22P waard detektearre by deselde retinsjetiid as earder bepaald. De suverens fan 'e ekstrahearre ferbiningen waard doe kontrolearre troch HPLC-MS/MS lykas hjirboppe beskreaun.
Totaal RNA waard ekstrahearre út 10-12 reproduktive weefsels of oare dielen fan it lichem (kopleas) mei TRI-reagens (Thermo Fisher) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. RNA waard behannele mei TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA waard synthetisearre mei Moloney murine leukemia firus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. Primers foar reverse transkripsje kwantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) waarden earder publisearre24 of ûntworpen mei Primer-BLAST26, mei foarkar foar produkten fan 70-150 bp yn grutte en dy't exon-exon-oergongen omfetsje of Primerpearprimers skiede exons. cDNA-samples fan trije oant fjouwer biologyske replikaten waarden fjouwer kear ferdund yn wetter foar RT-qPCR. Kwantifikaasje waard útfierd yn 15 µl replikaatreaksjes mei 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers en 5 µl ferdund cDNA. Reaksjes waarden útfierd op in QuantStudio 6 Pro real-time PCR-systeem (Thermo Fisher) en gegevens waarden sammele en analysearre mei Design and Analysis (ferzje 2.4.3). Lykas oantoand yn dizze stúdzje, waarden relative hoemannichten normalisearre nei it ribosomale gen RpL19 (AGAP004422), waans ekspresje net signifikant feroare mei bloedfieding 27 of paring 3.
RNA-kwaliteit waard kontrolearre mei in Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina paired-end bibleteken waarden taret en útfierd by it Broad Institute fan MIT en Harvard. Sekwinsjelêzingen waarden ôfstimd op it A. gambiae-genoom (PEST-stam, ferzje 4.12) mei HISAT2 (ferzje 2.0.5) mei standertparameters. Lêslêzingen mei mappingkwaliteit (MAPQ) skoares <30 waarden fuorthelle mei Samtools (ferzje 1.3.1). It oantal lêzingen dat oan genen keppele wie, waard teld mei htseq-count (ferzje 0.9.1) mei standertparameters. Normalisearre lêzingstellingen waarden berekkene en differinsjele genekspresje analysearre mei it DESeq2-pakket (ferzje 1.28.1) yn R (ferzje 4.0.3).
Ecdysone-modifisearjende genkandidaten waarden identifisearre troch earst it A. gambiae-genoom te sykjen mei it PSI-BLAST-algoritme (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), mei standertwearden Parameters mei de folgjende query-proteinsekwinsjes: fan Bombyx mori (Tagongsnûmer NP_001038956.1), Musca domestica (Tagongsnûmer XP_005182020.1, XP_005175332.1 en XP_011294434.1) en Microplitis demolitor (Tagongsnûmer XP_008552646.1 en XP_008552645.1) EcK fan B. mori (Tagongsnûmer NP_001036900), Drosophila melanogaster (Tagongsnûmer NP_651202), Apis mellifera (Tagongsnûmer XP_394838) en Acyrthosiphon pisum (Tagongsnûmer XP_001947166); en EPP fan B. mori (Tagongsnûmer XP_001947166) NP_001177919.1 en NP_001243996.1) en EO fan D. melanogaster (Tagongsnûmer NP_572986.1) (stap 1). Filterje dêrnei treffers op basis fan hege mRNA-ekspresje (>100 fragminten/kilobase-eksons per miljoen yn kaart brochte lêzingen (FPKM) of >85%) yn reproduktyf weefsel (froulike LRT of MAG) yn Gambia (stap 2). Om de spesifisiteit te ferbetterjen, hawwe wy kandidaat-enzymen selektearre dy't ek útdrukt wurde yn it reproduktive weefsel fan A. albimanus, in anopheles-soarte dy't gjin ecdysone synthetisearret of oerdraacht tidens de paring. Kandidaatgenen waarden filtere op basis fan lege ekspresje (<100 FPKM of <85e persintyl) yn A. albimanus reproduktyf weefsel (stap 3). As in lêste filter (stap 4) moatte kandidaatgenen oan teminsten ien fan 'e folgjende foldwaan: (1) signifikant opregulearre nei de paring (P < 0,05) neffens de analyze fan ferskillend útdrukte genen en (2) yn net-reproduktive weefsels (< 85% of <100 FPKM).
Wy hawwe earder beskreaun metoaden 28,29,30 oanpast om isotopyske labeling fan it hiele organisme te berikken. Koartsein, wyldtype Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) waard test yn giststikstofbasis (BD Difco, DF0335) mei (wt/vol) 2% glukoaze (G7528, Sigma), 1,7% aminosoerfrij en ammoniumsulfaatkultuermedium) en 5% 15N ammoniumsulfaat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) as ienige boarne fan stikstof. Gist waard weromwûn troch sintrifugaasje en muggenlarven waarden ad libitum fiede oant de ferpopping. Oanfolling mei fiskmiel (0,5 mg per 300 larven) om mortaliteit yn it fjirde stadium te foarkommen. Allinnich wyfkes waarden doe brûkt yn paringseksperiminten mei net-labelde mantsjes om it manlike proteoom te analysearjen dat tidens de paring oerdroegen waard.
4-6 dagen âlde 15N-tagged jongfaam wyfkes waarden twongen om te paren mei leeftyd-oerienkommende jongfaam mantsjes sûnder tag. Súksesfolle paring waard ferifiearre troch it detektearjen fan paringspluggen ûnder epifluoreszinsjemikroskopie. Op 3, 12 en 24 hpm waarden de atria fan 45-55 parde wyfkes dissekearre yn 50 µl ammoniumbikarbonaatbuffer (pH 7.8) en homogenisearre mei in stamper. It homogenaat waard sintrifugearre en de supernatant mingd mei 50 µl fan 0.1% RapiGest (186001860, Waters) yn 50 mM ammoniumbikarbonaat. De supernatant en pellet fan elk monster waarden fluch beferzen op droech iis en oernachtich ferstjoerd nei it MacCoss-laboratoarium oan 'e Universiteit fan Washington, dêr't de tarieding fan monsters foar LC-MS/MS foltôge waard. Resuspendearje de pellet yn 50 µl fan 0.1% RapiGest yn 50 mM ammoniumbikarbonaat en sonikear yn in wetterbad. De proteïnekonsintraasje fan 'e pellet en supernatant waard metten troch de BCA-assay, samples waarden redusearre mei 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylearre mei 15 mM iodoacetamide (Sigma) en ynkubearre by 37 °C (1:0 50) foar 1 oere mei trypsinisaasje: trypsin:substraatferhâlding). RapiGest waard lysearre troch de tafoeging fan 200 mM HCl, folge troch ynkubaasje by 37 °C foar 45 minuten en sintrifugaasje by 14.000 rpm foar 10 minuten by 4 °C om pún te ferwiderjen. Samples waarden wosken troch dûbele modus fêste-faze ekstraksje (Oasis MCX cartridges, Waters) en resuspendearre yn 0,1% mierensoer foar in definitive proteïnekonsintraasje fan 0,33 µg µl-1. Unlabelde MAG-proteomen waarden op deselde wize analysearre fan jongfaamlike mantsjes. Twa analytyske replikaten waarden analysearre foar elk sample. Dêrnei waard 1 µg fan elk analysearre mei in 25-cm fused silica 75-μm kolom mei in 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) fritfalle ynpakt mei Jupiter C12 omkearde-faze hars (Phenomenex) en 180-minuten floeistofchromatografy. Sample digests - MS/MS waard útfierd op in Q-Exactive HF-massaspektrometer (Thermo Fisher) mei in nanoACQUITY UPLC System (Waters). Gegevensrelatearre akwisysjegegevens generearre foar elke run waarden omset nei mzML-formaat mei Proteowizard (ferzje 3.0.20287) en mei Comet31 (ferzje 3.2) tsjin de FASTA-database mei proteïnesekwinsjes fan Anopheles gambiae (VectorBase ferzje 54), Anopheles coluzzi. In sykopdracht waard útfierd op Mali-NIH (VectorBase ferzje 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, maart 2021), A. gambiae RNA-seq, en trije-frame-oersettings fan bekende minsklike fersmoarging. Peptidekaart-matched FDR's waarden bepaald mei Percolator32 (ferzje 3.05) mei in drompel fan 0.01, en peptiden waarden gearstald yn proteïne-identifikaasjes mei proteïneparsimony yn Limelight33 (ferzje 2.2.0). De relative proteïne-oerfloed waard skatte mei de normalisearre spektrale oerfloedfaktor (NSAF) dy't berekkene waard foar elk proteïne yn elke run lykas earder beskreaun. NSAF relatyf oan elk proteïne waard gemiddeld oer samples fan twa ferskillende biologyske replikaten. 15N-labeling maskearre mei súkses it froulike proteoom, hoewol in lytse hoemannichte net-labelde proteïne koe wurde detektearre fan 'e labelde jongfammen. Wy hawwe de deteksje fan manlike proteïnereduksje (1-5 spektra) yn froulike rauwe samples allinich registrearre yn technyske runs, wêrby't rauwe samples waarden útfierd nei manlike/paringsmonsters, as gefolch fan HPLC "carry over". Sa no en dan proteïnen fûn as 'fersmoargjende stoffen' fan labelde jongfammen wurde neamd yn Oanfoljende Tabel 1.
Twa antigenyske peptiden, QTTDRVAPAPDQQQ (binnen isotype PA) en MESDGTTPSGDSEQ (binnen isotype PA en PB) yn Genscript. De twa peptiden waarden kombinearre, doe konjugearre oan it dragerprotein KLH en ynjektearre yn Nij-Seelânske kninen. De kninen waarden nei de fjirde ynjeksje opoffere, en totaal IgG waard isolearre troch affiniteitssuvering. IgG fan it meast EPP-spesifike knyn waard brûkt foar fierdere western blotting.
Foar western blots, MAG (n = 10, wêrby't n it oantal biologysk ûnôfhinklike muggenmonsters fertsjintwurdiget) en froulike LRT (n = 30) fan 4 dagen âlde jongfaammantsjes en jongfaam- of twongen parende wyfkes (<10 nei paring), waard proteïne-ekstraksjebuffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natriumdeoxycholaat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease-ynhibitorcocktail (Roche)) apart tafoege. De monsters waarden direkt nei disseksje homogenisearre mei in beader (2 mm glêzen kralen, 2.400 rpm, 90 sek). Unoplosber pún waard fuorthelle troch sintrifugaasje by 20.000 g by 4 °C. Proteïnen waarden kwantifisearre troch Bradford-assay (Bio-Rad). Dêrnei waarden 20 µg MAG-proteïne, 40 µg LRT-proteïne en 20 µg oerbleaune bulkproteïne denaturearre en skieden troch 10% Bis-Tris NuPAGE mei MOPS-buffer. Proteïnen waarden oerdroegen nei polyvinylideenfluoridemembranen mei it iBlot2-oerdrachtsysteem (Thermo Fisher). Membranen waarden twa kear wosken yn 1 × PBS-T (0,1% Tween-20 yn PBS) en doe blokkearre yn Odyssey-blokkearbuffer (Li-Cor) foar 1 oere by 22 °C. Membranen waarden oernacht skodde by 4 °C mei oanpaste knine-anti-EPP polyklonale primêre antistof (1:700 yn blokkearbuffer) en rat-anti-actine monoklonale primêre antistof MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membranen waarden wosken mei PBS-T en doe ynkubearre mei sekundêre antistoffen (ezel-anti-knine 800CW en geite-anti-rat 680LT (Li-Cor), beide 1:20.000) yn blokkearbuffer mei 0,01% SDS en 0,2% Tween-20 foar 1 oere by 22 °C. Membranen waarden wosken mei PBS-T en ôfbylde mei in Odyssey CLx-scanner. Ofbyldings waarden sammele en ferwurke yn Image Studio (ferzje 5.2). In spesifike band dy't oerienkomt mei it EPP-RA-isoform (82 kDa) waard net ûntdutsen.
De kodearjende regio's fan EPP (as isoform AGAP002463-RB mei histidinefosfatasedomein, NCBI conserved domain search 34) en EcK2 (AGAP002181) waarden klonearre yn pET-21a(+) plasmide (Novagen Millipore Sigma); primers binne neamd yn útwreide gegevenstabel 2. Acht GS4-linkers (yn tandem) waarden ynfoege foar de C-terminale 6xHis-tag fan 'e pET-21a(+)-EcK2-konstruksje. Rekombinante proteïnen waarden produsearre mei de NEBExpress selfrije E. coli-proteïnesynthesereaksje (New England BioLabs). Rekombinante proteïnen waarden suvere mei NEBExpress Ni-spinkolommen (New England BioLabs). Dihydrofolaatreduktase (DHFR) kontrôleproteïne waard produsearre mei DNA-sjabloan fan 'e NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Proteïnen waarden opslein yn 50% glycerol yn PBS by -20 °C foar maksimaal 3 moannen.
Fosfatase-aktiviteit fan EPP en weefselekstrakten waard metten mei 4-nitrofenylfosfaat (pNPP; Sigma-Aldrich). De reaksjebuffer befette 25 mM Tris, 50 mM jittiksoer, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, en 1 mM DTT. Weefsel waard homogenisearre yn reaksjebuffer en selresten waarden fuorthelle troch sintrifugaasje. Begjin de reaksje troch enzyme of weefselekstrakt ta te foegjen oan reaksjebuffer mei 2,5 mg ml-1 pNPP. It reaksjemingsel waard by keamertemperatuer yn it tsjuster ynkubearre, en de hoemannichte pNP dy't omset waard fan pNPP waard kwantifisearre troch de absorbânsje te mjitten by 405 nm op ferskate tiden.
Foar in vitro EcK-aktiviteit waard it proteïne ynkubearre mei 0,2 mg 20E of 3D20E yn 200 µl buffer (pH 7,5) mei 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP en 10 mM MgCl2 foar 2 oeren by 27 °C. De reaksje waard stoppe troch it tafoegjen fan 800 µl methanol, doe ôfkuolle by -20 °C foar 1 oere, en doe sintrifugearre by 20.000 g foar 10 minuten by 4 °C. De supernatant waard doe analysearre troch HPLC-MS/MS. Om de proteïnen dy't yn 'e kontrôlegroep brûkt waarden mei waarmte-inaktivaasje te meitsjen, waarden de proteïnen 20 minuten by 95 °C ynkubearre yn 50% glycerol yn PBS.
Foar in vitro EPP-aktiviteit waard it proteïne ynkubearre mei 3D20E22P (lykweardich oan de hoemannichte fûn yn 18 pearen MAG, suvere troch HPLC-MS/MS) yn 100 µl buffer (pH 7.5) mei 25 mM Tris, 50 mM azijnzuur, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, en 1 mM DTT foar 3 oeren by 27 °C. De reaksje waard stoppe troch it tafoegjen fan 400 µl methanol en ôfkuolle by -20 °C foar 1 oere, doe sintrifugearre by 20.000 g foar 10 minuten by 4 °C. De supernatant waard analysearre troch HPLC-MS/MS.
PCR-fragminen foar EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) en EcK2 (556 bp) waarden amplifisearre út cDNA taret út kadavers fan kopleaze muggen fan mingd geslacht. It PCR-fragmin fan 'e eGFP-kontrôle (495 bp) waard amplifisearre út 'e earder beskreaune pCR2.1-eGFP; PCR-primers binne neamd yn útwreide gegevenstabel 2. It PCR-fragmint waard ynfoege tusken de omkearde T7-promotors op it pL4440-plasmide. Plasmidekonstruksjes waarden weromwûn út NEB 5-α kompetinte E. coli (New England Biolabs) en ferifiearre troch DNA-sekwinsje foar gebrûk (sjoch Oanfoljende gegevens 1 foar ynfoegsekwinsje). Primers dy't oerienkomme mei de T7-promotor (útwreide gegevenstabel 2) waarden brûkt om it ynfoegsel fan it op pL4440 basearre plasmide te amplifisearjen. De grutte fan it PCR-produkt waard befêstige troch agarosegelelektroforese. dsRNA waard transkribearre fan PCR-sjabloanen mei de Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) en suvere neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant mei de earder beskreaune modifikaasjes.
Foar dsRNA-ynjeksje waard 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ynjektearre yn in konsintraasje fan 10 ng nl-1 yn 'e boarstkas fan folwoeksen manlju of froulju (Nanoject III, Drummond) binnen 1 dei nei eclosion. Gen-knockdownnivo's waarden bepaald yn teminsten trije biologyske replikaten troch RNA-ekstraksje, cDNA-synteze en RT-qPCR. Foar ecdysone-ynjeksje waarden 4 dagen âlde maagdelike of 6 dagen âlde maagdelike bloedfiede wyfkes ynjektearre mei 0,13, 0,21 of 0,63 µg fan 20E of 3D20E (Nanoject III, Drummond) yn konsintraasjes fan respektivelik 1,3 en 2,1, ôfhinklik fan it eksperimintele ûntwerp of 6,3 ng nl-1. Ynjektearje 100 nl fan 10% (vol/vol) ethanol yn wetter; 100 nl fan 3D20E22P yn 10% ethanol (lykweardich oan 75% fan 'e hoemannichte fûn yn in pear MAG's). Muggen waarden willekeurich tawiisd oan 'e ynjeksjegroep.
Foar paai-assays waarden 3-dagen âlde wyfkes ad libitum fiede mei minsklik bloed. Ferwiderje diels fiede of net fiede muggen. Ofhinklik fan 'e behanneling waarden wyfkes fjouwer nachten yn aparte paaibekers pleatst, teminsten 48 oeren nei de bloedmiel. Aaien waarden teld ûnder in stereoskoop (Stemi 508, Zeiss); foar pare wyfkes waarden aaien dy't útkomme as larven as fruchtber beskôge.
Foar paringsproeven krigen wyfkes teminsten 2 dagen, ôfhinklik fan 'e behanneling, om ferset tsjin paring te ûntwikkeljen, en wyldtype leeftydsmatchde mantsjes waarden dêrnei yn deselde koai ynbrocht. Twa nachten letter waarden de befruchte wyfkes fesikels dissekearre en genomysk DNA waard frijlitten troch friezen-dooijen en sonikaasje yn in buffer mei 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, en 25 mM NaCl (pH 8.2). De samples waarden ynkubearre mei Proteinase K (0.86 µg µl-1) foar 15 minuten by 55 °C, folge troch 10 minuten by 95 °C. Rûge genomyske DNA-preparaten waarden 10-fâld ferdund en ûnderwurpen oan qPCR-deteksje fan Y-chromosoomsekwinsjes; primers binne neamd yn útwreide gegevenstabel 2. Ofwêzigens fan Y-chromosoomsekwinsje jout gjin paring oan.
Foar opnij paringsassays waarden twongen pare wyfkes ûndersocht op 'e oanwêzigens fan paringspluggen om de paringsstatus te befêstigjen en waarden 2 dagen tastien om refraktêr te wurden foar paring yn 'e ôfwêzigens fan mantsjes, lykas earder beskreaun 36. Mantsjes dy't DsRed transgene sperma droegen, waarden doe yn wyfkeskoaien ynbrocht. Twa nachten letter waarden de befruchtjende vesikels fan 'e wyfkes dissekearre, en genomysk DNA waard taret lykas hjirboppe beskreaun en ûnderwurpen oan qPCR-deteksje fan it DsRed-transgen; primers binne neamd yn Extended Data Tabel 2. De ôfwêzigens fan it DsRed-transgen joech oan dat gjin opnij paring plakfûn.
3D20E waard synthetisearre lykas earder beskreaun 37. Koartsein, 10 mg fan 20E (Sigma-Aldrich) waard oplost yn 10 ml wetter, folge troch de tafoeging fan 30 mg platina swart (yn poeierfoarm, Sigma-Aldrich). In sêfte stream fan O2 waard kontinu yn it reaksjemingsel bubbele, dat by keamertemperatuer roerd waard. Nei 6 oeren waard 30 mL methanol tafoege om de reaksje te stopjen. It mingsel waard sintrifugearre om katalysatorpartikels te ferwiderjen. De supernatant waard yn fakuüm by keamertemperatuer droech ferdampt. It droege reaksjeprodukt waard oplost yn 10% ethanol en methanol foar ynjeksje foar HPLC-MS/MS-analyze. De konverzjerate (fan 20E nei 3D20E) wie sawat 97% (Fig. 4b), en it MS-spektrum fan 'e synthetisearre 3D20E kaam oerien mei dat fûn yn pare wyfkes (Fig. 4c).
De leginde befettet spesifike details fan 'e útfierde statistyske testen. GraphPad (ferzje 9.0) waard brûkt om de Fisher's eksakte test, Mantel-Cox-test en Student's t-test út te fieren. Cochran-Mantel-Haenszel-tests waarden útfierd mei in oanpast R-skript (beskikber op https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). De gegevensferdieling waard hifke op normaliteit mei de Shapiro-Wilk-test mei in betsjuttingsdrompel fan 0.05. Doe't de gegevens de normaliteitstest net hellen, waard de Mann-Whitney-test útfierd. Oerlibjensgegevens waarden analysearre mei de Mantel-Cox-test. It DESeq2-pakket (ferzje 1.28.1) waard brûkt om RNA-seq-gennivo-differinsjele ekspresje-analyze út te fieren. De horizontale balke op 'e grafyk fertsjintwurdiget de mediaan. In betsjuttingswearde fan P = 0.05 waard brûkt as de drompel foar alle testen.
Foar mear ynformaasje oer it ûndersyksûntwerp, sjoch de gearfetting fan it Nature Research Report dy't keppele is oan dit artikel.
MS proteomyske gegevens waarden deponearre yn it ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) fia de PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) mei de dataset-identifier PXD032157.
De RNA-seq-dataset is opslein yn 'e Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ûnder it seriële rekord GSE198665.
Oanfoljende datasets dy't generearre en/of analysearre binne tidens de hjoeddeiske stúdzje kinne op ridlik fersyk fan 'e oerienkommende auteurs krigen wurde. Dit artikel jout de boarnegegevens.
De Loof, A. Ekdysteroïden: Ferwaarloaze ynsektensekssteroïden? Manlju: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone en eierstokûntwikkeling yn Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).