Proteïnesortering yn it sekretoaryske paad is essensjeel foar it behâld fan selkompartmentalisaasje en homeostase. Neist skel-mediearre sortearring is de rol fan lipiden yn kinesinesortering yn it proses fan sekretoarysk transport in al lang besteande basisfraach dy't noch net beantwurde is. Hjir fiere wy 3D simultane mearkleurige hege-resolúsje real-time ôfbylding út om in vivo te bewizen dat nij synthetisearre glycosylfosfatidylinositol-immobilisearre proteïnen mei heul lange ceramide-lipide-eleminten klustere en klassifisearre binne yn spesjalisearre endoplasma's Net exit site, dy't oars is as dy brûkt troch transmembraanproteïnen. Derneist litte wy sjen dat de ketenlingte fan ceramide yn it endoplasmatysk reticulummembraan kritysk is foar dizze sortearselektiviteit. Us stúdzje leveret it earste direkte in vivo bewiis om proteïneladingen te klassifisearjen op basis fan lipideketenlingte yn selektive eksportplakken yn it sekretoaryske paad.
Yn eukaryote sellen wurde de proteïnen dy't synthetisearre binne yn it endoplasmatysk reticulum (ER) dan sortearre tidens transport fia de sekretoryske paad foar levering oan har passende sellulêre bestimming (1). Neist it sortearjen troch de mantel waard lang spekulearre dat bepaalde lipiden ek kinne tsjinje as selektive útgongspunten troch se te klusterjen yn spesifike membraandomeinen dy't spesifike proteïnen binne (2-5). D'r is lykwols noch in gebrek oan direkt in vivo bewiis om dit mooglike lipide-basearre meganisme te bewizen. Om dit basisprobleem op te lossen, hawwe wy yn gist bestudearre hoe't glycosylfosfatidylinositol (GPI) ferankere proteïnen (GPI-AP's) ferskillend eksportearre wurde fan it ER. GPI-AP's binne in ferskaat oan lipide-ferbûne sel-oerflakproteïnen (6, 7). GPI-AP is in útskieden proteïne dy't oan 'e bûtenste blêden fan it plasmamembraan is befestige fia de glycolipide-groep (GPI-anker). Se akseptearje GPI-ankers as konservative post-translasjonele modifikaasjes yn it ER-lumen (8). Nei it oanhechtsjen giet GPI-AP troch it Golgi-apparaat (5, 9) fan it ER nei it plasmamembraan. De oanwêzigens fan GPI-ankers feroarsaket dat GPI-AP apart fan transmembraan-ôfskieden proteïnen (ynklusyf oare plasmamembraanproteïnen) lâns it ôfskiedingspaad ferfierd wurdt (5, 9, 10). Yn gistsellen wurde GPI-AP's skieden fan oare ôfskieden proteïnen yn it endoplasmatysk reticulum, en dan ynpakt yn unike fesikels omwikkele troch mantelproteïnekompleks II (COPII) (6, 7). De bepalende faktoaren fan dit klassifikaasjeproses yn it ER-eksportproses binne ûndúdlik, mar der wurdt spekulearre dat dit meganisme lipiden fereasket, benammen de strukturele remodeling fan it lipidediel fan it GPI-anker (5, 8). Yn gist begjint GPI-lipide-remodeling direkt nei't de GPI oanhechtet, en yn in protte gefallen feroarsaket it dat ceramide bindt oan it 26-koalstof langekettige verzadigde fetsoer (C26:0) (11, 12). C26-ceramide is oant no ta de wichtichste ceramide dy't troch gistsellen produsearre wurdt. It wurdt synthetisearre yn it ER en it measte wurdt nei it Golgi-apparaat eksportearre fia COPII-vesikels (13). De ER-eksport fan GPI-AP fereasket spesifyk trochgeande ceramidesynteze (14, 15), en op syn beurt hinget de konverzje fan ceramide nei inositolfosfaatceramide (IPC) yn it Golgi-apparaat ôf fan GPI-ankersynteze (16). Biofysyske stúdzjes mei keunstmjittige membranen hawwe oantoand dat tige lange acylketenceramiden kinne gearfoegje om oardere domeinen te foarmjen mei unike fysike eigenskippen (17, 18). Dizze gegevens liede ta de hypoteze dat C26-ceramide en GPI-AP mei C26-ceramide har fysike eigenskippen brûke om gear te foegjen ta oarderlike regio's of regio's yn 'e relatyf rommelige ER-membraanlipide-omjouwing. It bestiet benammen út koarte en ûnfersêde glycerolipiden (C16:1 en C18:1) (19, 20). Dizze regio's sille selektyf rjochte wurde op spesifike ER-útgongsplakken (ERES), dêr't ceramide en ceramide-basearre GPI-AP ko-transportearre wurde kinne nei de Golgi yn deselde tawijde COPII-vesikel (5).
Yn dizze stúdzje hawwe wy dit lipide-basearre meganisme direkt hifke mei help fan super-resolúsje konfokale real-time imaging mikroskopie (SCLIM), in baanbrekkende mikroskopietechnyk dy't tagelyk fluoreszint labelde proteïnen kin observearje. De trijekleurige en trijediminsjonale (3D) ôfbyldings hawwe in ekstreem hege resolúsje en snelheid yn libbene sellen (21, 22).
Wy hawwe earst SCLIM-technology tapast om fierder te definiearjen hoe't normale GPI-AP mei C26-ceramidegroep waard screene fan transmembraan-sekretearde proteïnen nei it ferlitten fan it ER yn S. cerevisiae. Om de klassifikaasje fan ER te kontrolearjen, hawwe wy in genetysk systeem brûkt dat direkt nij synthetisearre lading kin visualisearje dy't ERES ynkomt yn vivo (7, 23). As lading hawwe wy keazen foar C26-ceramide-basearre GPI-AP Gas1 markearre mei grien fluorescerend proteïne (GFP) en transmembraan-sekreteare proteïne Mid2 markearre mei tichtby-ynfraread fluorescerend proteïne (iRFP), dy't beide rjochte binne op it plasmamembraan (24-26). Yn 'e sec31-1 temperatuergefoelige mutant wurde dizze twa ladingen útdrukt ûnder in galaktose-ynducearbere promotor en in konstitutive ERES-marker. By de ekstreme temperatuer (37 °C), om't de sec31-1-mutaasje de funksje fan COPII-coatkomponint Sec31 beynfloedet om COPII-kieming en ER-eksport te remmen, sammelet nij synthetisearre lading him op by it ER (23). Nei it ôfkuoljen nei in lege temperatuer (24 °C) herstelden de sec31-1-mutantsellen har út it sekretoryske gebiet, en de opboude nije syntetyske lading begûn te wurden eksportearre út it ER. CLIM-visualisaasje liet sjen dat it measte fan 'e nij synthetisearre Gas1-GFP en Mid2-iRFP noch opboud wiene yn it ER fan 'e sec31-1-mutantsellen nei ynkubaasje by 37 °C en doe frijlitten by 24 °C foar 5 minuten (Ofbylding 1). Om't Mid2-iRFP ferspraat is oer it heule ER-membraan, en Gas1-GFP konsintrearre en sammele is yn it ûnderbrutsen ER-membraangebiet, is har ferdieling folslein oars (Ofbylding 1, A oant C en Film S1). Derneist, lykas te sjen is yn Ofbylding 1D, hat it Gas1-GFP-kluster gjin Mid2-iRFP. Dizze resultaten jouwe oan dat GPI-AP en transmembraanproteinen betiid skieden waarden yn ferskate ER-membraanregio's. De Gas1-GFP-kluster leit neist in spesifike ERES dy't markearre is mei mCherry's COPII-mantelproteïne Sec13 (Ofbylding 1, E en F, en film S1) (23).
sec31-1-sellen ekspressearje galaktose-induzearre sekreten, in lange acylketen (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grien) en it transmembraanprotein Mid2-iRFP (TMP, blau) en dizze konstruktive ERES-labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) waard 30 minuten by 37 °C ynkubearre, nei 24 °C ferpleatst, en 5 minuten letter ôfbylde troch SCLIM. (A oant C) lit in represintative gearfoege of ienkele 2D-ôfbylding sjen fan in flak (A), in 2D-projeksjeôfbylding fan 10 z-seksjes (B) of in 3D-selhemisfearôfbylding fan lading en ERES-markers (C). Skaalbalke 1 μm (A en B). De skaalienheid is 0.551 μm (C). Gas1-GFP waard ûntdutsen yn aparte ER-regio's of klusters, wylst Mid2-iRFP waard ûntdutsen en ferspraat oer it ER-membraan (C). (D) De grafyk lit de relative fluoreszinsje-yntensiteit fan Gas1-GFP en Mid2-iRFP sjen yn it Gas1-GFP-kluster lâns de wite pylkline (lofts). AU, willekeurige ienheid. (E en F) fertsjintwurdigje de 3D-ôfbylding dy't de guod- en ERES-mark kombinearret. Gas1-GFP-klusters waarden ûntdutsen tichtby de spesifike ERES. De skaalienheid is 0.551μm. (F) De wite fêste pylk markearret it Gas1-GFP-kluster dat assosjeare is mei ERES. De middelste en rjochter panielen litte de gearfoege fergrutte 3D-ôfbylding en in rotearre werjefte fan it selektearre Gas1-GFP-kluster sjen.
De nauwe romtlike relaasje tusken it Gas1-GFP-kluster en in spesifike ERES jout oan dat Gas1-GFP selektive ERES yn kin gean, wat oars is as de selektiviteit dy't Mid2-iRFP brûkt om it ER te ferlitten. Om dizze mooglikheid oan te pakken, hawwe wy de ERES-ferhâlding kwantifisearre foar mar ien of twa guod (Ofbylding 2, A oant C). Wy hawwe fûn dat de measte ERES (70%) mar ien type lading befetsje. De ûnderste ôfbylding fan Ofbylding 2C lit twa typyske foarbylden sjen fan ERES mei allinich Gas1-GFP (Ofbylding 1) of allinich Mid2-iRFP (Ofbylding 2). Yn tsjinstelling befettet sawat 20% fan ERES twa ladingen dy't inoar oerlaapje yn itselde gebiet. It waard fûn dat guon ERES (10%) twa soarten lading befette, mar se waarden isolearre yn dúdlik ferskillende gebieten. Dêrom lit dizze statistyske analyze sjen dat nei't it ER eksportearre is, GPI-AP Gas1-GFP en de transmembraanlading Mid2-iRFP ferdield binne yn ferskillende ERES (Ofbylding 2D). Dizze sortearingseffisjinsje is tige yn oerienstimming mei de foarige biogemyske analyze (6) en morfologyske bepaling (7). Wy kinne ek it gedrach fan 'e yn karantêne set lading dy't ERES yngiet observearje (Ofbylding 2E en Film S2). Ofbylding 2E lit sjen dat mar in lyts diel fan Gas1-GFP (paniel 3) of Mid2-iRFP (paniel 4) de ERES fan ien kant yngiet en beheind is ta in apart gebiet. Paneel 5 fan Figuer 2E lit sjen dat Gas1-GFP en Mid2-iRFP soms yn deselde ERES fûn wurde, mar se komme fan ferskate kanten binnen en binne konsintrearre yn aparte regio's dy't ferskate COPII-vesikels kinne fertsjintwurdigje. Wy hawwe ek befêstige dat de waarnommen skieding en klassifikaasje fan C26-ceramide-basearre GPI-AP Gas1 as selektive ERES spesifyk is, om't in oare transmembraansekresjelading, it GFP-tagged plasmamembraanprotein Axl2 (27), ferlykber gedrach sjen lit as Mid2-iRFP. (Ofbylding S1 en Film S3). De nij synthetisearre Axl2-GFP wurdt ferspraat troch it ER-membraan lykas Mid2-iRFP (Ofbylding S1, A en B), en is ko-lokalisearre mei Mid2-iRFP yn 'e measte ERES (Ofbylding S1, B oant D). Panielen 1 en 2 fan Ofbylding 1. S1C litte twa typyske foarbylden fan ERES sjen wêr't twa transmembraanladingen inoar oerlaapje. Yn dizze gefallen komme beide guod tegearre ERES yn (Ofbylding S1E, Paniel 3 en Film S3).
De sec31-1-sellen dy't galaktose-ynducearbere sekreten ekspressearje, Gas1-GFP (GPI-AP, grien) en Mid2-iRFP (TMP, blau) en konstitutive ERES-labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) waarden pleatst op 37 °C. Nei 30 minuten ynkubearjen by °C, ferpleatst nei 24 °C om it sekresjeblok frij te meitsjen, en meitsje nei 20 minuten in ôfbylding mei SCLIM. (A oant C) Represintative 2D-projeksjeôfbyldings (A; skaalbalke, 1 μm) of 3D-selhemisfearôfbyldings (B en C; skaalienheid, 0,456 μm) fan 'e lading en 10 z-seksjes markearre mei ERES. It legere paniel yn (B) en it paniel yn (C) litte ferwurke ôfbyldings sjen om allinich de guod oanwêzich yn ERES (magenta) [Gas1-GFP (griis) en Mid2-iRFP (ljochtblau)]. (C) Iepen pylk: ERES draacht mar ien stik lading (1 oant 4). Grize pylk: ERES befettet segregearre lading (5). Wite fêste pylk: ERES mei ko-lokearre lading. Hjirûnder: De selektearre ienige ERES befettet allinich Gas1-GFP (1) of Mid2-iRFP (2). Skaalbalke, 100 nm. (D) Kwantifikaasje fan 'e fotomikrograaf beskreaun yn (C). It gemiddelde persintaazje fan ERES dat allinich ien lading befettet (Gas1-GFP of Mid2-iRFP), segregearre lading en oerlappende lading. Yn trije ûnôfhinklike eksperiminten, n = 432 yn 54 sellen. Foutbalke = SD. Twasidige unpaired t-test. *** P = 0.0002. (E) 3D-ôfbylding fan selektearre ERES fan karantêne lading markearre mei (C). Gas1-GFP (grien) (3) of Mid2-iRFP (blau) (4) komt ERES (magenta) yn fan ien kant en is beheind ta in lyts gebiet binnen ERES. Soms komme beide soarten lading deselde ERES (5) yn fan deselde kant en binne beheind ta in isolearre gebiet binnen de ERES. Skaalbalke, 100 nm.
Folgjende hawwe wy in hypoteze test dat de lange acylketen ceramide (C26) oanwêzich yn it ER-membraan de spesifike klustering en sortearring fan Gas1 yn selektive ERES oandriuwt. Hjirfoar hawwe wy in modifisearre giststam GhLag1 brûkt, wêryn't de twa endogene ceramidesynthasen Lag1 en Lac1 ferfongen waarden troch GhLag1 (de Lag1-homolooch fan katoen), wat resultearre yn in giststam mei in selmembraan Ceramidestam koarter as wyldtype (Ofbylding 3A) (28). Massaspektrometry (MS)-analyze liet sjen dat yn wyldtypestammen 95% fan 'e totale ceramide in tige lange (C26) keten ceramide is, wylst yn GhLag1 85% fan 'e ceramide tige lang is (C18 en C16), mar 2% fan 'e ceramide is in tige lange (C26) keten ceramide. Hoewol C18- en C16-ceramiden de wichtichste ceramiden binne dy't oant no ta yn it GhLag1-membraan ûntdutsen binne, befêstige MS-analyze ek dat it GPI-anker fan Gas1-GFP útdrukt yn 'e GhLag1-stam C26-ceramide befettet, wat te fergelykjen is mei wildtype-lipiden. De kwaliteit is itselde (Fig. 3A) (26). Dêrom betsjut dit dat it ceramide-remodellearjende enzyme Cwh43 tige selektyf is foar C26-ceramide, lykas te sjen is yn Figuer 26, it ynkorporearret by foarkar it GPI-anker fan in lytse hoemannichte C26-ceramide yn 'e GhLag1-stam. S2 (29). Nettsjinsteande befettet it selmembraan fan GhLag1 yn prinsipe allinich C18-C16-ceramide, wylst Gas1-GFP noch C26-ceramide hat. Dit feit makket dizze stam in ideaal ark om spesifyk it probleem fan 'e acylketenlingte fan membraanceramide yn it ER op te lossen. De hypotetyske rol fan klasse en sortearring. Doe hawwe wy earst it fermogen fan C26 Gas1-GFP bestudearre om te accumulearjen yn klusters yn GhLag1 mei in temperatuergefoelige mutante allel fan sec31-1 troch konvinsjonele fluoreszinsjemikroskopie, wêrby't allinich de lange (C18-C16) keten bestiet yn it ER-membraan Ceramide (Fig. 3). Wy hawwe waarnommen dat yn sec31-1 it measte fan Gas1-GFP konsintrearre wie yn klusters, wylst Gas1-GFP yn sec31-1 GhLag1 mei lange (C18-C16) lange ceramide ER-membraan benammen net klustere en ferspraat wie yn it heule ER-membraan. Om krekt te wêzen, om't C26-ceramide-basearre klustering nau besibbe is oan spesifike ERES (Figuer 1), hawwe wy dêrnei ûndersocht oft dit proses ek de funksje fan it ER-eksportproteïnemeganisme kin omfetsje. GPI-AP brûkt in spesjaal COPII-systeem foar ER-eksport, dat aktyf regele wurdt troch Ted1's strukturele remodeling fan it glykaandiel fan it GPI-anker (30, 31). It rekombinante GPI-glykaan wurdt dan erkend troch it transmembraan cargo receptor p24-kompleks, dat op syn beurt selektyf Lst1 rekrutearret, in spesifike isoform fan 'e wichtichste COPII cargo-binende subunit Sec24, wêrtroch in GPI-AP-rike COPII ûntstiet. Vesikels binne nedich (31-33). Dêrom hawwe wy in dûbele mutant konstruearre dy't de ferwidering fan dizze ienige proteïnen (de p24-komplekskomponint Emp24, GPI-glykaan-remodelearjende enzyme Ted1 en de spesifike COPII-subunit Lst1) kombinearre mei de sec31-1 mutantstam, en se bestudearre. Is it mooglik om Gas1-kluster GFP te foarmjen (Ofbylding 3). Wy hawwe waarnommen dat yn sec31-1emp24Δ en sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP benammen net-klustere is en ferspraat is oer it ER-membraan, lykas earder sjoen yn sec31-1 GhLag1, wylst yn sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Lykas sec31-1. Dizze resultaten jouwe oan dat neist de oanwêzigens fan C26-ceramide yn it ER-membraan, de klustering fan Gas1-GFP ek moat bine oan it p24-kompleks, en gjin spesifike Lst1-rekrutearring fereasket. Dêrnei hawwe wy de mooglikheid ûndersocht dat de ketenlingte fan ceramide yn it ER-membraan de binding fan Gas1-GFP oan p24 kin regelje. Wy hawwe lykwols fûn dat de oanwêzigens fan C18-C16-ceramide yn it membraan gjin ynfloed hat op de GPI-glykanen dy't rekonstruearre binne troch it p24-kompleks (figueren S3 en S4, A en B) of de binding oan GPI-AP en it eksportearjen fan GPI-AP. Rekrute COPII-subtype Lst1 (figuer S4C). Dêrom fereasket C26-ceramide-ôfhinklike klustering gjin proteïne-ynteraksjes mei ferskate ER-eksportproteïnemeganismen, mar stipet in alternatyf sortearmeganisme dat oandreaun wurdt troch lipidelingte. Dêrnei hawwe wy analysearre oft de ceramide-acylketenlingte yn it ER-membraan wichtich is foar de effektive klassifikaasje fan Gas1-GFP as selektive ERES. Omdat Gas1 yn 'e GhLag1-stam mei koarte-keten ceramide it ER ferlit en it plasmamembraan yngiet (figuer S5), leauwe wy dat as de sortearring oandreaun wurdt troch de lingte fan 'e ceramide-acylketen, de Gas1 yn 'e GhLag1-stam omlaat en oerstutsen wurde kin. ERES-guod mei itselde membraan.
(A) It selmembraan fan GhLag1 befettet benammen koartere C18-C16 ceramiden, wylst it GPI-anker fan Gas1-GFP noch deselde C26 IPC hat as wildtype sellen. Hjirboppe: acylketenlingte-analyze fan ceramide yn it selmembraan fan wildtype (Wt) en GhLag1p-stammen troch massaspektrometry (MS). De gegevens fertsjintwurdigje it persintaazje totale ceramide. It gemiddelde fan trije ûnôfhinklike eksperiminten. Foutbalke = SD. Twasidige ûnpare t-test. **** P <0.0001. Underste paniel: MS-analyze fan 'e acylketenlingte fan' e IPC oanwêzich yn it Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-anker útdrukt yn it wildtype en GhLag1p-stammen. De gegevens fertsjintwurdigje it persintaazje totale IPC-sinjaal. Gemiddelde fan fiif ûnôfhinklike eksperiminten. Foutbalke = SD. Twasidige ûnpare t-test. ns, net wichtich. P = 0.9134. (B) Fluoreszinsjemikrografen fan sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ en sec31-1lst1Δ sellen dy't galaktose-induzearre Gas1-GFP ekspressearje waarden ynkubearre by 37 °C foar 30 minuten en trochjûn oan Fier routine fluoreszinsjemikroskopie út nei 24 °C. Wite pylk: ER Gas1-GFP kluster. Iepen pylk: Unclustered Gas1-GFP is ferspraat oer it heule ER-membraan, en toant de karakteristike ER-nukleêre ringkleuring. Skaalbalke, 5 μm. (C) Kwantifikaasje fan 'e fotomikrograaf beskreaun yn (B). It gemiddelde persintaazje sellen mei punktearre Gas1-GFP-struktuer. Yn trije ûnôfhinklike eksperiminten, n≥300 sellen. Foutbalke = SD. Twasidige ûnpare t-test. **** P <0.0001.
Om dit probleem direkt op te lossen, hawwe wy SCLIM-visualisaasje útfierd fan Gas1-GFP en Mid2-iRFP yn GhLag1 mei it temperatuergefoelige mutante allel sec31-1 (figuer 4 en film S4). Nei't it ER by 37 °C bewarre waard en dêrnei by 24 °C frijlitten waard, wie it measte fan 'e nij synthetisearre Gas1-GFP net klustere en ferspraat oer it ER-membraan, lykas waarnommen troch konvinsjonele mikroskopen (figuer 4, A en B). Derneist omfettet in grut persintaazje fan ERES (67%) twa soarten lading dy't dêryn tegearre lokalisearre binne (figuer 4D). Panielen 1 en 2 fan figuer 4C litte twa typyske foarbylden sjen fan ERES mei oerlappende Gas1-GFP en Mid2-GFP. Derneist waarden beide guod rekrutearre yn deselde ERES (figuer 4E, paniel 3 en film S4). Dêrom jouwe ús resultaten oan dat de lingte fan 'e ceramide-acylketen yn it ER-membraan in wichtige determinant is fan ER-proteïneaggregaasje en klassifikaasje.
Sec31-1 GhLag1-sellen dy't galaktose-induzearre sekreten ekspressearje, Gas1-GFP (GPI-AP, grien) en Mid2-iRFP (TMP, blau) en konstitutive ERES-labelde Sec13-mCherry (ERES, magenta). Ynkubearje by 37 °C. Trochgean foar 30 minuten, sakje nei 24 °C om sekreten frij te meitsjen, en meitsje ôfbyldings mei SCLIM nei 20 minuten. (A oant C) Represintative 2D-projeksjeôfbyldings (A; skaalbalke, 1 μm) of 3D-selhemisfearôfbyldings (B en C; skaalienheid, 0.45 μm) fan 'e 10 z-seksjes markearre troch lading en ERES. It legere paniel yn (B) en it paniel yn (C) litte ferwurke ôfbyldings sjen om allinich de guod oanwêzich yn ERES (magenta) te werjaan [Gas1-GFP (griis) en Mid2-iRFP (ljochtblau)]. (C) Wyt folle pylk: ERES, guod oerlaapje inoar. Iepen pylk: ERES befettet mar ien item. Underste paniel: De selektearre ERES hat oerlappende guod (1 en 2) markearre yn (C). Skaalbalke, 100 nm. (D) Kwantifikaasje fan 'e fotomikrografy beskreaun yn (C). Yn 'e sec31-1 en sec31-1 GhLag1-ienheden is mar ien lading (Gas1-GFP of Mid2-iRFP) opnommen, en it gemiddelde persintaazje fan ERES foar isolearre lading en oerlappende lading. Yn trije ûnôfhinklike eksperiminten, n = 432 yn 54 sellen (sec31-1) en n = 430 yn 47 sellen (sec31-1 GhLag1). Foutbalke = SD. Twasidige ûnpare t-test. *** P = 0.0002 (sec31-1) en ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-ôfbylding fan selektearre ERES mei oerlappende lading (3) markearre yn (C). Gas1-GFP (grien) en Mid2-iRFP (blau) benaderje ERES (magenta) fan deselde kant en bliuwe yn itselde ERES-beheinde gebiet. Skaalbalke, 100 nm.
Dizze stúdzje leveret direkt in vivo bewiis dat lipide-basearre proteïneladingen wurde klassifisearre yn selektive eksportplakken yn 'e sekretoryske paad, en lit it belang fan acylketenlingte foar klassifikaasjeselektiviteit sjen. Mei help fan in krêftige en baanbrekkende mikroskopietechnyk neamd SCLIM, hawwe wy de nij synthetisearre Gas1-GFP (in wichtige plasmamembraan GPI-AP mei in heul lange acylketen (C26) ceramide lipidediel) yn gist demonstrearre. De regio's klustere yn aparte ER's binne assosjeare mei spesifike ERES, wylst transmembraan-sekretearde proteïnen ferspraat binne oer it ER-membraan (figuer 1). Derneist komme dizze twa soarten guod selektyf yn ferskate ERES (figuer 2). De acylketenlingte fan 'e sellulêre ceramide yn it membraan wurdt fermindere fan C26 nei C18-C16, it Gas1-GFP-kluster wurdt ûnderbrutsen yn 'e aparte ER-regio, en Gas1-GFP wurdt omlaat om it ER te ferlitten mei it transmembraanproteïne fia deselde ERES (figuer 3 en figuer 3). 4).
Hoewol GPI-AP in spesjalisearre proteïnemeganisme brûkt om ER te ferlitten, hawwe wy fûn dat C26-ceramide-ôfhinklike skieding net fertrout op ferskillende proteïne-ynteraksjes dy't kinne liede ta ERES-spesjalisaasje (Figuren S4 en S5). Ynstee dêrfan stypje ús befiningen in alternatyf klassifikaasjemeganisme dat oandreaun wurdt troch lipide-basearre proteïneklustering en de neifolgjende útsluting fan oare ladingen. Us waarnimmings jouwe oan dat de Gas1-GFP-regio of kluster dy't assosjeare wurdt mei in spesifike ERES it transmembraan-sekretearde proteïne Mid2-iRFP mist, wat oanjout dat de C26-ceramide-ôfhinklike GPI-AP-kluster har yngong yn 'e relevante ERES sil fasilitearje, en tagelyk transmembraan útslute. De sekreten komme dizze bepaalde ERES yn (Figuren 1 en 2). Yn tsjinstelling, feroarsaket de oanwêzigens fan C18-C16-ceramiden yn it ER-membraan net dat GPI-AP regio's of klusters foarmet, sadat se transmembraan-sekretearde proteïnen net útslute of ferfange yn deselde ERES (Figuren 3 en 4). Dêrom stelle wy foar dat C26-ceramide skieding en klassifikaasje oandriuwt troch it fasilitearjen fan it klustearjen fan aaiwiten keppele oan spesifike ERES.
Hoe kinne jo dizze C26-ceramide-ôfhinklike klustering yn in spesifyk ER-gebiet berikke? De oanstriid fan membraanceramide om lateraal te skieden kin derfoar soargje dat GPI-AP en C26-ceramide lytse en direkt oardere lipiden foarmje yn 'e mear unregelmjittige lipide-omjouwing fan it ER-membraan mei koartere en ûnfersêde glycerolipiden. Kwaliteitsklusters (17, 18). Dizze lytse tydlike klusters kinne fierder fusearre wurde ta gruttere, stabiler klusters nei binding oan it p24-kompleks (34). Yn oerienstimming hjirmei hawwe wy oantoand dat C26 Gas1-GFP ynteraksje moat hawwe mei it p24-kompleks om gruttere sichtbere klusters te foarmjen (Ofbylding 3). It p24-kompleks is in heterozygote oligomeer gearstald út fjouwer ferskillende p24-transmembraanproteinen yn gist (35), dy't multivalente binding leveret, wat kin liede ta crosslinking fan lytse GPI-AP-klusters, wêrtroch gruttere stabile klusters ûntsteane (34). De ynteraksje tusken de proteïne-ectodomeinen fan GPI-AP's kin ek bydrage oan har aggregaasje, lykas oantoand tidens har Golgi-transport yn sûchdierpolarisearre epitheelzellen (36). As C18-C16-ceramide lykwols oanwêzich is yn it ER-membraan, sille der gjin grutte aparte klusters foarme wurde as it p24-kompleks oan Gas1-GFP bindt. It ûnderlizzende meganisme kin ôfhingje fan 'e spesifike fysike en gemyske eigenskippen fan it lange acylketenceramide. Biofysyske stúdzjes fan keunstmjittige membranen litte sjen dat hoewol sawol lange (C24) as koarte (C18-C16) acylketenceramiden fazeskieding kinne feroarsaakje, allinich lange acylketenceramiden (C24) in hege kromming en filmbûging kinne befoarderje om de film opnij te foarmjen. Troch ûnderlinge referinsje (17, 37, 38). It is oantoand dat de transmembraanhelix fan TMED2, de minsklike homolooch fan Emp24, selektyf ynteraksje hat mei C18 ceramide-basearre sfingomyeline yn 'e cytoplasmatyske lobulen (39). Mei help fan molekulêre dynamika (MD) simulaasjes hawwe wy fûn dat sawol C18 as C26 ceramiden har ophopje om 'e cytoplasmatyske lobulen fan 'e Emp24 transmembraanhelix, en se hawwe ferlykbere foarkarren (Ofbylding S6). It is it neamen wurdich dat dit oanjout dat de transmembraanhelix fan Emp24 kin liede ta asymmetryske ferdieling fan lipiden yn it membraan. Dit is in resint resultaat basearre op sûchdiersellen. Ferlykbere MD-simulaasjes litte ek de oanwêzigens fan etherlipiden sjen (40). Dêrom spekulearje wy dat C26 ceramide yn 'e twa lobulen fan ER26 lokaal ferrike is. As GPI-AP yn 'e luminale lobulen direkt bindt oan multivalente p24 en de opgarjen fan C26-ceramide om p24 hinne yn 'e cytoplasmatyske lobulen, kin it de begeliedende proteïneaggregaasje befoarderje en wurde membraankromming generearre troch de fingers (41), wêrtroch't GPI-AP skiedt yn aparte regio's neist ERES, wat ek de tige kromme regio's fan it ER-membraan befoarderet (42). Eardere rapporten stipen it foarstelde meganisme (43, 44). De multivalente binding fan oligolectinen, patogenen of antistoffen oan ceramide-basearre glycosphingolipiden (GSL) op it plasmamembraan triggert grutte GSL-aggregaasje, ferbetteret fazeskieding en feroarsaket membraandeformaasje en internalisaasje (44). Iwabuchi ensfh. (43) It waard fûn dat yn 'e oanwêzigens fan lange (C24) mar net koarte (C16) acylketens, de multivalente ligand bûn oan GSL-laktosylceramide de foarming fan grutte klusters en membraaninvaginaasje feroarsake, en de cytoplasma-Lyn-bemiddelde sinjaaltransduksje op 'e leaflets wurdt ynterdigitearre troch acylketens yn keppele neutrofilen.
Yn sûchdierpolarisearre epitheelzellen kontrolearret de konsintraasje fan it anti-Golgi-netwurk (TGN) oant it nivo fan it apikale plasmamembraan de skieding en sortearring fan GPI-AP (10, 45). Dizze aggregaasje wurdt oandreaun troch GPI-AP-oligomerisaasje (36), mar it kin ek ôfhingje fan 'e lingte fan' e ceramideketen dy't wy fine yn gist. Hoewol sûchdier-GPI-AP in anker op basis fan etherlipiden hat, en syn gemyske struktuer is tige oars as de heul lange acylketenceramide, fûn in resinte stúdzje dat beide lipiden evolúsjonêr ferlykbere fysike en gemyske eigenskippen en funksje hawwe (40). Dêrom kin it etherlipide-diel yn sûchdierzellen fergelykber wêze mei de C26-ceramide yn gist, en syn rol is om te assosjearjen mei de lange-ketenceramide yn it membraan om GPI-AP-aggregaasje en sortearring te befoarderjen. Hoewol dizze mooglikheid noch direkt hifke wurde moat, stypje eardere befiningen dat it transport fan 'e lange acylketenceramide nei it Golgi-lichem net útfierd wurdt troch cytoplasmatyske oerdrachtproteinen, mar ôfhinklik is fan' e synteze fan GPI-ankers lykas gist. Dêrom liket it evolúsjonêre konservative meganisme yn steat te wêzen om selektyf tige lange acylketen ceramide en GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) yn itselde transportvesikel te ko-transportearjen.
Yn gist- en sûchdierpolarisearre epitheelselsystemen fine GPI-AP-aggregaasje en skieding fan oare plasmamembraanproteinen allegear plak foardat se it seloerflak berikke. Paladino et al. (48) fûnen dat op 'e TGN fan sûchdierpolarisearre epitheelzellen GPI-AP-klustering net allinich needsaaklik is foar de selektive klassifikaasje fan GPI-AP's nei it apikale plasmamembraan, mar ek de klusterorganisaasje fan GPI-AP's en syn biologyske aktiviteit regelet. Seloerflak. Yn gist liet dizze stúdzje sjen dat de C26-ceramide-ôfhinklike GPI-AP-kluster op it ER de klusterorganisaasje en funksjonele aktiviteit fan GPI-AP op it plasmamembraan kin regelje (24, 49). Yn oerienstimming mei dit model binne GhLag1-sellen allergysk foar GPI-ynhibitoren of medisinen dy't de yntegriteit fan 'e selwand beynfloedzje (28), en de needsaak foar funksjonele Gas1-GFP-klusters (49) fan 'e tipceramide dy't projektearre wurdt yn 'e paring fan gistsellen jout oan dat G​​​ Mooglike fysiologyske gefolgen fan hLag1-sellen binne. GPI-AP-flater. Fierdere testen oft de funksjonele organisaasje fan it seloerflak programmearre is fanút it ER troch in sortearmetoade basearre op lipidlengte sil lykwols it ûnderwerp wêze fan ús takomstich ûndersyk.
De Saccharomyces cerevisiae-stammen dy't yn dit wurk brûkt binne, binne neamd yn tabel S1. De MMY1583- en MMY1635-stammen fan SCLIM foar live selôfbylding waarden konstruearre op 'e eftergrûn fan W303. Dizze stammen dy't Sec13-mCherry ekspressearje mei in fluoreszinte proteïne-tag waarden konstruearre mei in polymerasekettingreaksje (PCR)-basearre metoade mei pFA6a-plasmide as sjabloan (23). De stam dy't Mid2-iRFP ekspressearret, markearre mei fluoreszint proteïne ûnder kontrôle fan 'e GAL1-promotor, waard as folget konstruearre. PCR-amplifikaasje fan iRFP-KanMx-sekwinsje fan pKTiRFP-KAN-fektor (kado fan E. O'Shea, Addgene-plasmidenûmer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ûndersyksboarne-identifikator (RRID): Addgene_64687) en ynfoege yn 'e C-terminus fan endogene Mid2. Nei't de Mid2-iRFP-genoomsekwinsje amplifisearre en klonearre wie yn 'e GAL1-promotor, waard it yntegrearre yn 'e Not I-Sac I-side fan it yntegraasjeplasmide pRS306. It resultearjende plasmide pRGS7 waard linearisearre mei Pst I om te yntegrearjen yn 'e URA3-lokus.
It Gas1-GFP-fúzjegen wurdt útdrukt ûnder de kontrôle fan 'e GAL1-promotor yn it sintromeer (CEN) plasmide, dat as folget konstruearre is. De Gas1-GFP-sekwinsje waard amplifisearre troch PCR fan it pRS416-GAS1-GFP plasmide (24) (jefte fan L. Popolo) en klonearre yn 'e Xma I-Xho I-side fan it CEN plasmide pBEVY-GL LEU2 (jefte fan C). Miller; Addgene plasmidenûmer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). It resultearjende plasmide waard pRGS6 neamd. It Axl2-GFP-fúzjegen wurdt ek útdrukt ûnder de kontrôle fan 'e GAL1-promotor fan 'e pBEVY-GL LEU2-fektor, en de konstruksje dêrfan is as folget. De Axl2-GFP-sekwinsje waard amplifisearre fan pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmide (23) troch PCR, en klonearre yn 'e BamHI-PstI-side fan 'e pBEVY-GL LEU2-fektor. It resultearjende plasmide waard pRGS12 neamd. De sekwinsje fan 'e oligonukleotiden dy't yn dizze stúdzje brûkt binne, stiet neamd yn tabel S2.
De stam waard oanfolle mei 0,2% adenine en 2% glukoaze [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] ryk gistextract proteïne p (YP) medium (1% gistextract en 2% proteïne ept). (YPR)] of 2% galaktose [YP-galaktose (YPG)] as koalstofboarne, of yn in synthetysk minimaal medium (0,15% giststikstofbase en 0,5% ammoniumsulfaat) om passende aminosoeren en basen oan te foljen dy't nedich binne foar fieding, en mei 2% glukoaze (synthetysk glukoazeminimaal medium) of 2% galaktose (synthetysk galaktoseminimaal medium) as koalstofboarne.
Foar real-time ôfbylding waarden temperatuergefoelige sec31-1 mutante sellen dy't it konstrukt ûnder de GAL1-promotor ekspressearren, oernachtich oant midden-logaritmyske faze groeid yn YPR-medium by 24 °C. Nei ynduksje yn YPG by 24 °C foar 1 oere waarden de sellen 30 minuten ynkubearre yn SG by 37 °C, en doe oerbrocht nei 24 °C om frij te meitsjen fan it sekresjeblok. Concanavalin A waard brûkt om de sellen op in glêzen dia te fixearjen en ôfbylde troch SCLIM. SCLIM is in kombinaasje fan in Olympus IX-71 omkearde fluoreszinsjemikroskoop en in UPlanSApo 100 × 1.4 numerike apertuer oaljelens (Olympus), in hege-snelheid en hege-sinjaal-lûdsferhâlding rotearjende skiif konfokale scanner (Yokogawa Electric), in oanpaste spektrometer en in oanpaste koeling. De ôfbyldingsfersterker fan it systeem (Hamamatsu Photonics) kin in fergrutglêssysteem leverje mei in definitive fergrutting fan × 266.7 en in lading-keppele apparaatkamera dy't elektroanen fermannichfâldiget (Hamamatsu Photonics) (21). Ofbyldingsakwisysje wurdt útfierd troch oanpaste software (Yokogawa Electric). Foar 3D-ôfbyldings hawwe wy in oanpaste piezoelektryske aktuator brûkt om de objektivlens fertikaal te triljen, en de optyske ûnderdielen 100 nm útinoar yn in stapel sammele. De Z-stack-ôfbylding wurdt omset yn 3D voxelgegevens, en de teoretyske puntspreidingsfunksje dy't brûkt wurdt foar de rotearjende skiif konfokale mikroskoop wurdt brûkt foar dekonvolúsjeferwurking troch Volocity-software (PerkinElmer). Troch gebrûk te meitsjen fan Volocity-software om automatysk de drompel foar ko-lokaasje-analyze te bepalen, waard ERES ynklusyf lading metten. Line scan-analyze waard útfierd mei MetaMorph-software (Molecular Devices).
Brûk de GraphPad Prism-software om statistyske betsjutting te bepalen. Foar de twasidige Student's t-test en de gewoane ienwegs fariânsjeanalyse (ANOVA)-test wurde ferskillen tusken groepen beskôge as in wichtige ynfloed op P <0.05 (*).
Foar fluoreszinsjemikroskopie fan Gas1-GFP waarden de log-faze sellen oernachtich groeid yn YPD en sammele troch sintrifugaasje, twa kear wosken mei fosfaatbufferde sâltwetter, en ynkubearre op iis foar teminsten 15 minuten, en doe ûnder de mikroskoop behannele lykas earder beskreaun Kontrôle (24). De Leica DMi8 mikroskoop (HCX PL APO 1003/1.40 oalje PH3 CS) foarsjoen fan in objektivlens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu-kamera en Application Suite X (LAS X) software waard brûkt foar akwisysje.
De samples waarden denaturearre mei SDS-samplebuffer by 65 °C foar 10 minuten, en doe skieden troch SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Foar immunoblotting-analyze waard 10 μl sample per baan laden. Primêr antistof: Brûk polyklonaal anti-Gas1 fan knine by in ferdunning fan 1:3000, polyklonaal anti-Emp24 fan knine by in ferdunning fan 1:500, en polyklonaal anti-GFP fan knine (in kado fan H. Riezman) by in ferdunning fan 1:3000. It monoklonale anti-Pgk1-antistof fan mûs waard brûkt by in ferdunning fan 1:5000 (in kado fan J. de la Cruz). Sekundêr antistof: Mierikswortelperoxidase (HRP) konjugeare geite-anti-knine-immunoglobuline G (IgG) brûkt by in ferdunning fan 1:3000 (Pierce). HRP-konjugeare geite-anti-mûs IgG waard brûkt yn in ferdunning fan 1:3000 (Pierce). De ymmúnreaksjesône waard waarnommen mei de chemilumineszinsjemetoade fan SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Lykas beskreaun yn (31), waard in natuerlik immunopresipitaasje-eksperimint útfierd op 'e ferrike ER-fraksje. Koartsein, waskje gistsellen mei TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride en protease-ynhibitormingsel) by 600 nm (OD600) by 100 optyske tichtens twa kear. It waard brutsen mei glêzen kralen, en doe waarden it selôffal en de glêzen kralen fuorthelle troch sintrifugaasje. De supernatant waard doe sintrifugearre by 17.000 g foar 15 minuten by 4 °C. De pellet waard opnij suspendearre yn TNE en digitalis saponine waard tafoege oant in einkonsintraasje fan 1%. De suspensje waard 1 oere ynkubearre mei rotaasje by 4 °C, en doe waarden de ûnoplosbere komponinten fuorthelle troch sintrifugaasje by 13.000 g by 4 °C foar 60 minuten. Foar Gas1-GFP-immunopresipitaasje, ynkubearje it stekproef earst foarôf mei lege agarose-kralen (ChromoTek) by 4 °C foar 1 oere, en ynkubearje it dan mei GFP-Trap_A (ChromoTek) by 4 °C foar 3 oeren. De immunopresipitearre kralen waarden fiif kear wosken mei TNE mei 0,2% digoxigenine, eluearre mei SDS-samplebuffer, skieden op SDS-PAGE, en analysearre troch immunoblotting.
Lykas beskreaun yn (31), waard de crosslinking-bepaling útfierd op 'e ferrike ER-fraksje. Koartsein, de ferrike ER-fraksje waard ynkubearre mei 0,5 mM dithiobis(succinimidylpropionaat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Feriene Steaten; 20 °C, 20 min). De crosslinking-reaksje waard ûnderbrutsen troch it tafoegjen fan glycine (50 mM einkonsintraasje, 5 minuten, 20 °C).
Lykas earder beskreaun (50), waard MS-analyze fan ceramide yn wildtype en GhLag1-stammen útfierd. Koartsein, sellen waarden groeid nei eksponentiële faze (3 oant 4 OD600-ienheden/ml) yn YPD by 30 °C, en 25 × 107 sellen waarden rispe. Harren metabolisme wurdt ûnderdrukt mei trichloorazijnzuur. Brûk ekstraksjeoplosmiddel [ethanol, wetter, ether, pyridine en 4,2 N ammoniumhydrokside (15:15:5:1:0,018 v/v)] en 1,2 nmol ynterne standert C17 ceramide (860517, Avanti polar lipide) kwaliteit). Brûk monomethylamine-reagens [methanol, wetter, n-butanol en methylamine-oplossing (4:3:1:5 v/v)] om mylde alkaline hydrolyse fan it ekstrakt út te fieren, en brûk dan wetterferzadigde n-butanol om te ûntsâlten. Uteinlik waard it ekstrakt opnij suspendearre yn in oplosmiddel yn positive modus [chloroform/methanol/wetter (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetaat] en ynjektearre yn 'e massaspektrometer. Multi-reaksjemonitoring (MRM) waard útfierd foar de identifikaasje en kwantifikaasje fan sfingolipidemolekulen. De TSQ Vantage tertiêre quadrupoalmassaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) is foarsjoen fan in robotyske nanoflow-ionboarne Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) foar lipide-analyze. De botsingsenerzjy is optimalisearre foar elke ceramidekategory. MS-gegevens waarden krigen yn positive modus. Foar elke biologyske replikaat is it lipidesignaal de mediaan fan trije ûnôfhinklike mjittingen.
Lykas beskreaun yn (31), waarden de sellen (800 × 107) dy't Gas1-GFP ekspressearren ûnderwurpen oan natuerlike immunopresipitaasje. De suvere Gas1-GFP waard skieden troch SDS-PAGE en oerdroegen nei in polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. It proteïne waard fisualisearre troch PVDF te kleurjen mei amide swart. De Gas1-GFP-bân waard fan 'e PVDF ôfsnien en 5 kear wosken mei methanol en ien kear mei floeistofchromatografy-MS (LC-MS) kwaliteit wetter. Troch de membraanstrip te ynkubearjen mei 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer en 500 μl farsk oplost 1 M natriumnitritmingsel by 37 °C foar 3 oeren, wurdt de lipidefraksje frijlitten út Gas1-GFP en lysearre. Frijlitting fan inosinefosfaatceramide tusken glucosamine en inositol (51). Dêrnei waard de membraanstrip fjouwer kear wosken mei LC-MS kwaliteit wetter, droege by keamertemperatuer, en opslein yn in stikstofatmosfear by -80 °C oant analyze. As kontrôle waard foar elk eksperimint in blanko stekproef fan PVDF-membraan brûkt. It lipide dat út Gas1-GFP ekstrahearre waard, waard doe analysearre troch MS lykas beskreaun (50). Koartsein, PVDF-strips mei GPI-lipide waarden opnij suspendearre yn 75μl negatyf skimmeloplosmiddel [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammoniumacetaat] en troch elektrospray-ionisaasje (ESI)-MRM/MS-analyze fan sfingolipidsoarten (TSQ Vantage) ûndergien. Yn dit gefal waarden MS-gegevens krigen yn negative ionmodus.
Lykas earder neamd, waard it lipidediel fan it GPI-anker skieden fan 'e [3H]-inositol-labelde GPI-AP (16). De lipiden waarden skieden troch tinnelaachchromatografy mei in oplosmiddelsysteem (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) en visualisearre mei FLA-7000 (Fujifilm).
De sellen dy't Gas1-GFP (600 × 107) ekspressearren waarden twa kear wosken mei TNE-buffer, en brutsen mei glêzen kralen, en doe sintrifugearre om selstoarresten en glêzen kralen te ferwiderjen. De supernatant waard doe sintrifugearre by 17.000 g foar 1 oere by 4 °C. De pellet waard wosken yn TNE en ynkubearre mei 1 U PI-PLC (Invitrogen) yn TNE mei 0,2% digitalis saponine foar 1 oere by 37 °C. Nei de enzymbehanneling waard it membraan fuorthelle troch sintrifugaasje by 17.000 g by 4 °C foar 1 oere. Om Gas1-GFP te immunopresipitearjen, waard de supernatant oernachts ynkubearre mei GFP-Trap_A (ChromoTek) by 4 °C. De suvere Gas1-GFP skieden troch SDS-PAGE waard kleurd mei Coomassie briljantblau. De Gas1-GFP-kleuringsbân waard ôfsnien fan it griis om it akwadukt hinne, en nei alkylaasje mei jodoacetamide en reduksje mei dithiothreitol waard in-gel-spiisfertarring mei trypsine útfierd. Ekstrahearje en droegje tryptyske peptiden en peptiden mei GPI-glykanen. It droege peptide waard oplost yn 20 μl wetter. Ynjeksjearje in diel (8μl) yn 'e LC. In oktadecylsilan (ODS) kolom (Develosil 300ODS-HG-5; binnendiameter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) waard brûkt om peptiden te skieden ûnder spesifike gradiëntomstannichheden. De mobile faze is oplosmiddel A (0,08% mierensoer) en oplosmiddel B (0,15% mierensoer yn 80% acetonitril). In Accela HPLC-systeem (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) waard brûkt om de kolom mei oplosmiddel A binnen 55 minuten te eluearjen mei in streamingsnelheid fan 50 μl min-1 foar 5 minuten, en doe waard de konsintraasje fan oplosmiddel B ferhege nei 40%. , Feriene Steaten). It eluaat waard kontinu ynfierd yn 'e ESI-ionboarne, en de tryptyske peptiden en peptiden mei GPI-glykanen waarden analysearre troch LTQ Orbitrap XL (hybride lineêre ionentrap-orbitrap massaspektrometer; Thermo Fisher Scientific). Yn 'e MS-opstelling waard de spanning fan' e kapillêre boarne ynsteld op 4,5 kV, en de temperatuer fan 'e oerdrachtkapillêr waard hâlden op 300 °C. De kapillêre spanning en buislensspanning waarden ynsteld op respektivelik 15 V en 50 V. MS-gegevens waarden krigen yn 'e positive ionmodus (resolúsje fan 60.000; massa-krektens fan 10 dielen per miljoen) yn in massaberik fan 300/m/z massa/ladingsferhâlding (m/z) 3000. De MS/MS-gegevens wurde krigen fia de ionenfalle yn 'e LTQ Orbitrap XL [de earste 3 sifers wêrfan de gegevens ôfhinklik binne, botsing-induzearre dissosiaasje (CID)].
MD-simulaasjes waarden útfierd mei GROMACS (52) software en MARTINI 2 krêftfjild (53-55). De CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) waard doe brûkt om in dûbele laach te bouwen mei dioleoylfosfatidylcholine (DOPC) en Cer C18 of DOPC en Cer C26. De topology en koördinaten fan Cer C26 binne ôflaat fan DXCE troch de ekstra kralen fan 'e sfingosinesturt te ferwiderjen. Brûk it hjirûnder beskreaune proses om de dûbele laach te balansearjen en it út te fieren, brûk dan de lêste koördinaten fan it systeem om in systeem te bouwen mei Emp24. It transmembraandomein fan gist Emp24 (residuen 173 oant 193) waard konstruearre as in α-helix mei de fisuele MD (VMD) ark molekulêre struktuer (58). Doe, nei it fuortheljen fan 'e oerlappende lipiden, waard it proteïne grof granulearre en ynfoege yn 'e dûbele laach mei CHARMM GUI. It definitive systeem befettet 1202 DOPC en 302 Cer C26 of 1197 DOPC en 295 Cer C18 en Emp24. Ionisearje it systeem nei in konsintraasje fan 0.150M. Fjouwer ûnôfhinklike replikaten waarden makke foar twa dûbele laachkomposysjes.
De lipide bilaach wurdt balansearre mei it CHARMM GUI-proses, dat it minimalisearjen en dan balansearjen fan 405.000 stappen omfettet, wêrby't de posysjebeperkingen stadichoan wurde fermindere en eliminearre, en de tiidstap wurdt ferhege fan 0,005 ps nei 0,02 ps. Nei lykwicht produseart it 6 µs mei in tiidstap fan 0,02 ps. Nei it ynfoegjen fan Emp24, brûk itselde CHARMM GUI-proses om it systeem te minimalisearjen en te balansearjen, en draai dan 8 s yn produksje.
Foar alle systemen wurdt de druk tidens it balansearringsproses regele troch de Berendsen-barostaat (59), en tidens it produksjeproses wurdt de druk regele troch de Parrinello-Rahman-barostaat (60). Yn alle gefallen is de gemiddelde druk 1 bar en wurdt in semi-isotropysk drukkoppelingsskema brûkt. Yn it balansearrings- en produksjeproses wurdt in termostaat (61) mei snelheidsherkalibraasje brûkt om de temperatuer fan respektivelik proteïne-, lipide- en oplosmiddelpartikels te keppeljen. Tidens de hiele operaasje is de doeltemperatuer 310K. De net-biningsynteraksje wurdt berekkene troch in pearlist te generearjen mei it Verlet-skema mei in buffertolerânsje fan 0,005. De Coulomb-term wurdt berekkene mei it reaksjefjild en in ôfsnijôfstân fan 1,1 nm. De Vander Waals-term brûkt in ôfsnijôfstân mei in ôfsnijôfstân fan 1,1 nm, en it Verlet-ôfsnijôfstânsskema wurdt brûkt foar potinsjele drift (62).
Mei help fan VMD is de ôfsnijgolflingte tusken DOPC-fosfaatkralen of ceramide AM1-kralen en it proteïne 0,7 nm, en it oantal lipiden dat ynteraksje hat mei it proteïne wurdt berekkene. Neffens de folgjende formule, berekkenje de depleasje-ferrikingsfaktor (DE) lykas yn (63): DE-faktor = (de hoemannichte totale lipiden yn it proteïne 0,7) yn it proteïne 0,7 (de hoemannichte Cer yn totale lipiden)
De rapportearre wearde wurdt krigen as in gemiddelde, en de flaterbalken binne fjouwer ûnôfhinklike kopyen fan SE. De statistyske betsjutting fan 'e DE-faktor wurdt berekkene troch t-test [(gemiddeldeDE-faktor-1)/SE]. Berekkene de P-wearde út 'e iensidige ferdieling.
De GROMACS-ark waard brûkt om de 2D laterale tichtheidskaart te berekkenjen fan it systeem dat Emp24 befettet binnen de lêste 250 ns fan it spoar. Om de ferrikings-/útputtingskaart fan ceramide te krijen, wurdt de tichtheidskaart fan Cer dield troch de som fan 'e kaart fan Cer en DOPC, en dan dield troch de konsintraasje fan Cer yn it lichem. Deselde kleurkaartskaal wurdt brûkt.
Foar oanfoljende materialen foar dit artikel, sjoch http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dit is in iepen tagongsartikel ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, dy't it gebrûk, de distribúsje en de reproduksje yn elk medium tastiet, salang't it definitive gebrûk net foar kommersjeel gewin is en it útgongspunt is dat it orizjinele wurk korrekt is. Referinsje.
Opmerking: Wy freegje jo allinich om jo e-mailadres op te jaan, sadat de persoan dy't jo oanbefelje oan 'e pagina wit dat jo wolle dat se de e-mail sjogge en dat it gjin spam is. Wy sille gjin e-mailadressen fêstlizze.
Dizze fraach wurdt brûkt om te testen oft jo in besiker binne en automatyske spamferstjoering te foarkommen.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero (Wagho) (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-ôfbylding mei hege resolúsje yn echte tiid lit it belang fan 'e lingte fan 'e ceramideketen sjen foar it sortearjen fan proteïne yn selektive útfierplakken.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Sergio -Linero (Wagho) (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-ôfbylding mei hege resolúsje yn echte tiid lit it belang fan 'e lingte fan 'e ceramideketen sjen foar it sortearjen fan proteïne yn selektive útfierplakken.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rjochten foarbehâlden. AAAS is in partner fan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.