Wy hawwe earder rapportearre dat serumnivo's fan 'e út 'e darm ôflaatte tryptofaanmetaboliet indole-3-propionzuur (IPA) leger binne by pasjinten mei leverfibrose. Yn dizze stúdzje hawwe wy it transkriptoom en DNA-metyloom yn obese levers ûndersocht yn relaasje ta serum-IPA-nivo's, lykas de rol fan IPA by it ynducearjen fan fenotypyske ynaktivaasje fan leverstellaatsellen (HSC's) yn vitro.
De stúdzje omfette 116 obese pasjinten sûnder type 2-diabetes mellitus (T2DM) (leeftyd 46,8 ± 9,3 jier; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) dy't bariatryske sjirurgy ûndergien hawwe yn it Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Sirkulearjende IPA-nivo's waarden metten troch floeistofchromatografy-massaspektrometry (LC-MS), levertranskriptoomanalyse waard útfierd troch totale RNA-sekwinsje, en DNA-metylaasjeanalyse waard útfierd mei de Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Minslike leverstellaatsellen (LX-2) waarden brûkt foar in vitro-eksperiminten.
Serum IPA-nivo's korrelearren mei de ekspresje fan genen dy't belutsen binne by apoptotyske, mitofagyske en longevity-paden yn 'e lever. It AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1)-gen wie it meast foarkommende en dominante ynteraksjegen yn 'e levertranskript- en DNA-metylaasjeprofilen. IPA-behanneling feroarsake apoptose, fermindere mitochondriale respiraasje, en feroare selmorfology en mitochondriale dynamyk troch it modulearjen fan 'e ekspresje fan genen dy't bekend binne om fibrose, apoptose en oerlibjen fan LX-2-sellen te regeljen.
Mei-inoar stypje dizze gegevens dat IPA potinsjele terapeutyske effekten hat en apoptose kin indusearje en it HSC-fenotype nei in ynaktive steat kin ferskowe, wêrtroch't de mooglikheid om leverfibrose te remmen útwreide wurdt troch te bemuoien mei HSC-aktivaasje en mitochondriale metabolisme.
De prevalinsje fan obesitas en metabolysk syndroom is assosjeare mei in tanimmende ynsidinsje fan metabolysk assosjeare fettige leversykte (MASLD); de sykte treft 25% oant 30% fan 'e algemiene befolking [1]. It wichtichste gefolch fan MASLD-etiology is leverfibrose, in dynamysk proses karakterisearre troch trochgeande opgarjen fan fibrose ekstrasellulêre matrix (ECM) [2]. De wichtichste sellen dy't belutsen binne by leverfibrose binne hepatyske stellaatsellen (HSC's), dy't fjouwer bekende fenotypen fertoane: rêstich, aktivearre, ynaktivearre en senescent [3, 4]. HSC's kinne aktivearre wurde en transdifferinsjearje fan in rêstige foarm yn proliferative fibroblast-achtige sellen mei hege enerzjybehoeften, mei ferhege ekspresje fan α-glêde spieraktine (α-SMA) en type I kollageen (Col-I) [5, 6]. Tidens leverfibrose-omkearing wurde aktivearre HSC's eliminearre fia apoptose of ynaktivaasje. Dizze prosessen omfetsje delregulearring fan fibrogene genen en modulaasje fan prosurvivalgenen (lykas NF-κB en PI3K/Akt-sinjaalpaden) [7, 8], lykas feroaringen yn mitochondriale dynamyk en funksje [9].
Serumnivo's fan 'e tryptofaanmetaboliet indool-3-propionzuur (IPA), produsearre yn 'e darm, binne fûn te wêzen fermindere yn minsklike metabolike sykten, ynklusyf MASLD [10–13]. IPA wurdt assosjeare mei dieetfezelynname, is bekend om syn antioxidant- en anty-inflammatoire effekten, en ferswakket it troch dieet feroarsake net-alkoholyske steatohepatitis (NASH) fenotype yn vivo en yn vitro [11–14]. Guon bewiis komt út ús eardere stúdzje, dy't oantoande dat serum IPA-nivo's leger wiene by pasjinten mei leverfibrose dan by obese pasjinten sûnder leverfibrose yn 'e Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Fierder hawwe wy oantoand dat IPA-behanneling de ekspresje fan genen koe ferminderje dy't klassike markers binne fan seladhesie, selmigraasje en hematopoëtyske stamselaktivaasje yn in minsklik leverstellaatsel (LX-2) model en in potinsjele hepatoprotektive metaboliet is [15]. It bliuwt lykwols ûndúdlik hoe't IPA leverfibrose-regresje ynducearret troch HSC-apoptose en mitochondriale bioenergetika te aktivearjen.
Hjir demonstrearje wy dat serum IPA assosjeare is mei de ekspresje fan genen dy't ferrike binne yn apoptose, mitofagy, en longevity-paden yn 'e lever fan obese, mar net-type 2-diabetes (KOBS) persoanen. Fierder hawwe wy fûn dat IPA de klaring en degradaasje fan aktivearre hematopoëtyske stamsellen (HSC's) kin indusearje fia it ynaktivaasjepad. Dizze resultaten litte in nije rol sjen foar IPA, wêrtroch't it in potinsjeel terapeutysk doelwyt is om leverfibrose-regression te befoarderjen.
In eardere stúdzje yn 'e KOBS-kohort liet sjen dat pasjinten mei leverfibrose legere sirkulearjende IPA-nivo's hiene yn ferliking mei pasjinten sûnder leverfibrose [15]. Om it potinsjele betiizjende effekt fan type 2-diabetes út te sluten, hawwe wy 116 obese pasjinten sûnder type 2-diabetes (gemiddelde leeftyd ± SD: 46,8 ± 9,3 jier; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) út 'e oanhâldende KOBS-stúdzje rekrutearre as de stúdzjepopulaasje [16]. Alle dielnimmers joegen skriftlike ynformearre tastimming en it stúdzjeprotokol waard goedkard troch de Etyske Kommisje fan it North Savo County Hospital yn oerienstimming mei de Ferklearring fan Helsinki (54/2005, 104/2008 en 27/2010).
Leverbiopsie-eksimplaren waarden nommen tidens bariatryske sjirurgy en histologysk beoardiele troch betûfte patologen neffens earder beskreaune kritearia [17, 18]. De beoardielingskritearia binne gearfette yn Oanfoljende Tabel S1 en binne earder beskreaun [19].
Fastende serummonsters waarden analysearre troch untargeted floeistofchromatografy-massaspektrometry (LC-MS) foar metabolomika-analyze (n = 116). Monsters waarden analysearre mei in UHPLC-qTOF-MS-systeem (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Dútslân) lykas earder beskreaun19. Identifikaasje fan isopropylalkohol (IPA) wie basearre op retinsjetiid en fergeliking fan it MS/MS-spektrum mei suvere standerts. De IPA-sinjaalintensiteit (peakgebiet) waard yn alle fierdere analyses beskôge [20].
RNA-sekwinsjearring fan 'e hiele lever waard útfierd mei Illumina HiSeq 2500 en gegevens waarden foarferwurke lykas earder beskreaun [19, 21, 22]. Wy hawwe rjochte differinsjele ekspresje-analyze útfierd fan transkripten dy't ynfloed hawwe op mitochondriale funksje/biogenese mei 1957 genen selektearre út 'e MitoMiner 4.0-database [23]. Lever-DNA-metylaasje-analyze waard útfierd mei de Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, Feriene Steaten) mei deselde metodyk as earder beskreaun [24, 25].
Minske leverstellaatsellen (LX-2) waarden freonlik beskikber steld troch Prof. Stefano Romeo en waarden kultivearre en ûnderhâlden yn DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Om de wurkdosis fan IPA te selektearjen, waarden LX-2-sellen 24 oeren behannele mei ferskate konsintraasjes fan IPA (10 μM, 100 μM en 1 mM; Sigma, 220027) yn DMEM/F12-medium. Fierder, om it fermogen fan IPA om HSC's te inaktivearjen te ûndersykjen, waarden LX-2-sellen 24 oeren lang behannele mei 5 ng/ml TGF-β1 (R&D-systemen, 240-B-002/CF) en 1 mM IPA yn serumfrij medium. Foar de oerienkommende kontrôles fan it auto waard 4 nM HCL mei 0,1% BSA brûkt foar TGF-β1-behanneling en 0,05% DMSO waard brûkt foar IPA-behanneling, en beide waarden tegearre brûkt foar de kombinaasjebehanneling.
Apoptose waard beoardiele mei de FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit mei 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, Feriene Steaten, Cat# 640922) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. Koartsein, LX-2 (1 × 105 sellen/put) waarden oernacht kultivearre yn platen mei 12 putten en doe behannele mei meardere doses IPA of IPA en TGF-β1. De oare deis waarden driuwende en oanhingjende sellen sammele, trypsinisearre, wosken mei PBS, opnij suspendearre yn Annexin V-bindingsbuffer, en 15 minuten ynkubearre mei FITC-Annexin V en 7-AAD.
Mitochondria yn libbene sellen waarden kleurd op oksidative aktiviteit mei Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Foar MTR-assays waarden LX-2-sellen ynkubearre by gelikense tichtheden mei IPA en TGF-β1. Nei 24 oeren waarden libbene sellen trypsinisearre, wosken mei PBS, en doe ynkubearre mei 100 μM MTR yn serumfrij medium by 37 °C foar 20 minuten lykas earder beskreaun [26]. Foar morfology-analyze fan libbene sellen waarden selgrutte en cytoplasmatyske kompleksiteit analysearre mei respektivelik foarútstribjende (FSC) en sydstribjende (SSC) parameters.
Alle gegevens (30.000 eveneminten) waarden sammele mei NovoCyte Quanteon (Agilent) en analysearre mei NovoExpress® 1.4.1 of FlowJo V.10 software.
Soerstofferbrûkssnelheid (OCR) en ekstrasellulêre fersuringssnelheid (ECAR) waarden yn realtime metten mei in Seahorse Extracellulêre Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) foarsjoen fan in Seahorse XF Cell Mito Stress neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. Koartsein waarden 2 × 104 LX-2 sellen/put siedde op XF96-selkultuerplaten. Nei ynkubaasje oernachts waarden sellen behannele mei isopropanol (IPA) en TGF-β1 (Oanfoljende Metoaden 1). Gegevensanalyse waard útfierd mei Seahorse XF Wave-software, dy't de Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator omfettet. Hjirút waard in Bioenergetyske Sûnensyndeks (BHI) berekkene [27].
Totaal RNA waard transkribearre yn cDNA. Foar spesifike metoaden, sjoch referinsje [15]. Human 60S ribosomaal soer proteïne P0 (RPLP0) en cyclophilin A1 (PPIA) mRNA-nivo's waarden brûkt as konstitutive genkontrôles. It QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederlân) waard brûkt mei de TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) of de Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), en relative genekspresjefold waard berekkene mei help fan ferlykjende Ct-wearde syklusparameters (ΔΔCt) en de ∆∆Ct-metoade. Details fan 'e primers wurde jûn yn oanfoljende tabellen S2 en S3.
Nukleêr DNA (ncDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA) waarden ekstrahearre mei de DNeasy bloed- en weefselkit (Qiagen) lykas earder beskreaun [28]. De relative hoemannichte mtDNA waard berekkene troch de ferhâlding fan elke doelwit mtDNA-regio ta it geometryske gemiddelde fan 'e trije nukleêre DNA-regio's (mtDNA/ncDNA) te berekkenjen, lykas detaillearre yn Oanfoljende Metoaden 2. Details fan 'e primers foar mtDNA en ncDNA wurde jûn yn Oanfoljende Tabel S4.
Libjende sellen waarden kleurd mei Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) om yntersellulêre en intrasellulêre mitochondriale netwurken te visualisearjen. LX-2-sellen (1 × 104 sellen/put) waarden kultivearre op glêzen objektglaasjes yn oerienkommende kultuerplaten mei in glêzen boaiem (Ibidi GmbH, Martinsried, Dútslân). Nei 24 oeren waarden libbene LX-2-sellen 20 minuten by 37 °C ynkubearre mei 100 μM MTR en waarden selkernen kleurd mei DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) lykas earder beskreaun [29]. Mitochondriale netwurken waarden visualisearre mei in omkearde Zeiss Axio Observer mikroskoop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Dútslân) foarsjoen fan in Zeiss LSM 800 konfokale module by 37 °C yn in befochtige sfear mei 5% CO2 mei in 63 × NA 1.3 objektyf. Wy hawwe tsien Z-searjeôfbyldings krigen foar elk stekproeftype. Elke Z-searje befettet 30 seksjes, elk mei in dikte fan 9,86 μm. Foar elk stekproef waarden ôfbyldings fan tsien ferskillende sichtfjilden krigen mei ZEN 2009-software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Dútslân), en mitochondriale morfology-analyze waard útfierd mei ImageJ-software (v1.54d) [30, 31] neffens de parameters detaillearre yn Oanfoljende Metoaden 3.
De sellen waarden fiksearre mei 2% glutaraldehyde yn 0.1 M fosfaatbuffer, folge troch fiksaasje mei 1% osmiumtetroxide-oplossing (Sigma Aldrich, MO, Feriene Steaten), stadichoan dehydratearre mei aceton (Merck, Darmstadt, Dútslân), en úteinlik ynbêde yn epoxyhars. Ultratinne seksjes waarden taret en kleurd mei 1% uranylacetaat (Merck, Darmstadt, Dútslân) en 1% leadcitraat (Merck, Darmstadt, Dútslân). Ultrastrukturele ôfbyldings waarden krigen mei in JEM 2100F EXII transmissie-elektronenmikroskoop (JEOL Ltd, Tokio, Japan) by in fersnellingsspanning fan 80 kV.
De morfology fan LX-2-sellen dy't 24 oeren mei IPA behannele waarden, waard analysearre troch fazekontrastmikroskopie by 50x fergrutting mei in omkearde ljochtmikroskoop fan Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 en AxioCam MRm, Jena, Dútslân).
Klinyske gegevens waarden útdrukt as gemiddelde ± standertôfwiking of mediaan (ynterkwartielberik: IQR). Ienwegsfariânsjeanalyse (kontinue fariabelen) of χ²-test (kategoryske fariabelen) waarden brûkt om ferskillen tusken de trije stúdzjegroepen te fergelykjen. It falsk-positive taryf (FDR) waard brûkt om te korrigearjen foar meardere testen, en genen mei FDR < 0.05 waarden as statistysk signifikant beskôge. Spearman-korrelaasjeanalyse waard brûkt om CpG-DNA-metylaasje te korrelearjen mei IPA-sinjaalintensiteit, mei nominale p-wearden (p < 0.05) rapportearre.
Paadanalyse waard útfierd mei in web-basearre ark foar gensetanalyse (WebGestalt) foar 268 transkripten (nominale p < 0.01), 119 mitochondria-assosjeare transkripten (nominale p < 0.05), en 4350 CpG's út 3093 levertranskripten dy't assosjeare wiene mei sirkulearjende serum IPA-nivo's. De frij beskikbere Venny DB (ferzje 2.1.0) ark waard brûkt om oerlappende genen te finen, en StringDB (ferzje 11.5) waard brûkt om proteïne-proteïne-ynteraksjes te visualisearjen.
Foar it LX-2-eksperimint waarden samples op normaliteit hifke mei de D'Agostino-Pearson-test. Gegevens waarden krigen fan teminsten trije biologyske replikaten en ûnderwurpen oan ienwegs ANOVA mei Bonferroni post hoc-test. In p-wearde fan minder as 0,05 waard as statistysk signifikant beskôge. Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± SD, en it oantal eksperiminten wurdt oanjûn yn elke figuer. Alle analyses en grafyken waarden útfierd mei de statistyske software GraphPad Prism 8 foar Windows (GraphPad Software Inc., ferzje 8.4.3, San Diego, Feriene Steaten).
Earst hawwe wy de assosjaasje fan serum IPA-nivo's mei lever-, lichems- en mitochondriale transkripten ûndersocht. Yn it totale transkriptprofyl wie it sterkste gen dat assosjeare waard mei serum IPA-nivo's MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-aktivearre proteïnekinase-aktivearre proteïnekinase 3); yn it mitochondria-relatearre transkriptprofyl wie it sterkste assosjeare gen AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/treonine kinase 1) (Ekstra bestân 1 en Ekstra bestân 2).
Wy hawwe doe globale transkripten (n = 268; p < 0.01) en mitochondria-assosjeare transkripten (n = 119; p < 0.05) analysearre, en úteinlik apoptose identifisearre as it wichtichste kanonike paad (p = 0.0089). Foar mitochondriale transkripten assosjeare mei serum IPA-nivo's, hawwe wy ús rjochte op apoptose (FDR = 0.00001), mitofagy (FDR = 0.00029), en TNF-sinjaalpaden (FDR = 0.000006) (Ofbylding 1A, Tabel 2, en Oanfoljende Figuren 1A-B).
Oerlappende analyze fan globale, mitochondria-assosjeare transkripten, en DNA-metylaasje yn minsklike lever yn assosjaasje mei serum IPA-nivo's. A stiet foar 268 globale transkripten, 119 mitochondria-assosjeare transkripten, en DNA-metylearre transkripten dy't yn kaart brocht binne nei 3092 CpG-plakken assosjeare mei serum IPA-nivo's (p-wearden < 0,01 foar globale transkripten en DNA-metylearre, en p-wearden < 0,05 foar mitochondriale transkripten). De wichtichste oerlappende transkripten wurde yn 'e midden werjûn (AKT1 en YKT6). B De ynteraksjekaart fan 'e 13 genen mei de heechste ynteraksjeskoare (0,900) mei oare genen waard konstruearre út 'e 56 oerlappende genen (swarte lineregio) dy't signifikant assosjeare wiene mei serum IPA-nivo's mei de online ark StringDB. Grien: Genen yn kaart brocht nei de sellulêre komponint fan Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 is it proteïne mei de heechste skoare (0.900) foar ynteraksjes mei oare proteïnen basearre op de gegevens (basearre op tekstmining, eksperiminten, databases en ko-ekspresje). Netwurkknooppunten fertsjintwurdigje proteïnen, en rânen fertsjintwurdigje ferbiningen tusken proteïnen.
Omdat metaboliten fan 'e darmflora epigenetyske gearstalling kinne regelje fia DNA-metylaasje [32], hawwe wy ûndersocht oft serum-IPA-nivo's ferbûn wiene mei lever-DNA-metylaasje. Wy fûnen dat de twa wichtichste metylaasjeplakken dy't ferbûn wiene mei serum-IPA-nivo's tichtby proline-serine-rike regio 3 (C19orf55) en waarmteskokproteinfamylje B (lyts) lid 6 (HSPB6) wiene (Oanfoljend bestân 3). DNA-metylaasje fan 4350 CpG (p < 0.01) wie korrelearre mei serum-IPA-nivo's en wie ferrike yn longevity-regulearjende paden (p = 0.006) (Ofbylding 1A, Tabel 2, en Oanfoljende Ofbylding 1C).
Om de biologyske meganismen te begripen dy't ûnderlizze oan 'e assosjaasjes tusken serum IPA-nivo's, globale transkripten, mitochondria-assosjeare transkripten, en DNA-metylaasje yn 'e minsklike lever, hawwe wy in oerlaapanalyse útfierd fan 'e genen dy't identifisearre binne yn 'e foarige paadanalyse (figuer 1A). De resultaten fan paadferrikingsanalyse fan 'e 56 oerlappende genen (binnen de swarte line yn figuer 1A) lieten sjen dat it apoptosepaad (p = 0.00029) twa genen markearre dy't mienskiplik binne foar de trije analyses: AKT1 en YKT6 (YKT6 v-SNARE homoloog), lykas te sjen is yn it Venn-diagram (Oanfoljende figuer 2 en figuer 1A). Nijsgjirrich is dat wy fûnen dat AKT1 (cg19831386) en YKT6 (cg24161647) posityf korrelearren mei serum IPA-nivo's (Oanfoljend bestân 3). Om potinsjele proteïne-ynteraksjes tusken genprodukten te identifisearjen, hawwe wy 13 genen selektearre mei de heechste mienskiplike regioskoare (0.900) ûnder 56 oerlappende genen as ynfier en in ynteraksjekaart konstruearre. Neffens it fertrouwensnivo (marginaal fertrouwen) stie it AKT1-gen mei de heechste skoare (0.900) boppe-oan (figuer 1B).
Op basis fan 'e paadanalyse fûnen wy dat apoptose it wichtichste paad wie, dus ûndersochten wy oft IPA-behanneling de apoptose fan HSC's yn vitro beynfloedzje soe. Wy hawwe earder oantoand dat ferskate doses IPA (10 μM, 100 μM, en 1 mM) net-giftig wiene foar LX-2-sellen [15]. Dizze stúdzje liet sjen dat IPA-behanneling by 10 μM en 100 μM it oantal libbensfetbere en nekrotyske sellen fergrutte. Yn ferliking mei de kontrôlegroep naam de sellibensfetberens lykwols ôf by in konsintraasje fan 1 mM IPA, wylst it selsekrosetaryf net feroare bleau (figuer 2A, B). Dêrnei, om de optimale konsintraasje te finen om apoptose yn LX-2-sellen te indusearjen, testen wy 10 μM, 100 μM, en 1 mM IPA foar 24 oeren (figuer 2A-E en oanfoljende figuer 3A-B). Nijsgjirrich is dat IPA 10 μM en 100 μM it taryf fan apoptose fermindere (%), lykwols, IPA 1 mM ferhege de lette apoptose en it taryf fan apoptose (%) yn ferliking mei de kontrôle en waard dêrom keazen foar fierdere eksperiminten (Figuren 2A-D).
IPA feroarsaket apoptose fan LX-2-sellen. Annexin V en 7-AAD dûbele kleuringsmetoade waarden brûkt om de apoptotyske taryf en selmorfology te kwantifisearjen troch flowcytometry. BA-sellen waarden ynkubearre mei 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA foar 24 oeren of mei F-H TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA yn serumfrij medium foar 24 oeren. A: libbene sellen (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotyske sellen (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: ier (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: let (Annexin V+/7AAD.+); E, H: persintaazje fan totale iere en lette apoptotyske sellen yn apoptotyske taryf (%). Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SD, n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. Statistyske fergelikingen waarden útfierd mei ienwegs ANOVA mei Bonferroni post hoc-test. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Lykas wy earder oantoand hawwe, kin 5 ng/ml TGF-β1 HSC-aktivaasje ynducearje troch de ekspresje fan klassike markergenen te ferheegjen [15]. LX-2-sellen waarden behannele mei 5 ng/ml TGF-β1 en 1 mM IPA yn kombinaasje (Fig. 2E–H). TGF-β1-behanneling feroare it taryf fan apoptose net, lykwols fergrutte IPA-ko-behanneling de lette apoptose en it taryf fan apoptose (%) yn ferliking mei TGF-β1-behanneling (Fig. 2E–H). Dizze resultaten jouwe oan dat 1 mM IPA apoptose yn LX-2-sellen ûnôfhinklik fan TGF-β1-ynduksje kin befoarderje.
Wy hawwe fierder it effekt fan IPA op mitochondriale respiraasje yn LX-2-sellen ûndersocht. De resultaten lieten sjen dat 1 mM IPA de parameters fan it soerstofferbrûk (OCR) ferlege: net-mitochondriale respiraasje, basale en maksimale respiraasje, protonlekkage en ATP-produksje yn ferliking mei de kontrôlegroep (Ofbylding 3A, B), wylst de bioenergetyske sûnensyndeks (BHI) net feroare.
IPA ferminderet mitochondriale respiraasje yn LX-2-sellen. De mitochondriale respiraasjekromme (OCR) wurdt presintearre as mitochondriale respiraasjeparameters (net-mitochondriale respiraasje, basale respiraasje, maksimale respiraasje, protonlek, ATP-generaasje, SRC en BHI). Sellen A en B waarden ynkubearre mei 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA foar respektivelik 24 oeren. Sellen C en D waarden ynkubearre mei TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA yn serumfrij medium foar respektivelik 24 oeren. Alle mjittingen waarden normalisearre nei DNA-ynhâld mei de CyQuant-kit. BHI: bioenergetyske sûnensyndeks; SRC: respiratoire reservekapasiteit; OCR: soerstofferbrûkssnelheid. Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± standertôfwiking (SD), n = 5 ûnôfhinklike eksperiminten. Statistyske fergelikingen waarden útfierd mei ienwegs ANOVA en Bonferroni post hoc-test. *p < 0.05; **p < 0.01; en ***p < 0.001
Om in mear wiidweidich begryp te krijen fan it effekt fan IPA op it bioenergetyske profyl fan TGF-β1-aktivearre LX-2-sellen, hawwe wy mitochondriale oksidative fosforylaasje analysearre troch OCR (Fig. 3C, D). De resultaten lieten sjen dat TGF-β1-behanneling de maksimale respiraasje, respiratoire reservekapasiteit (SRC) en BHI koe ferminderje yn ferliking mei de kontrôlegroep (Fig. 3C, D). Derneist fermindere de kombinaasjebehanneling basale respiraasje, protonlekkage en ATP-produksje, mar SRC en BHI wiene signifikant heger as dy behannele mei TGF-β1 (Fig. 3C, D).
Wy hawwe ek de "Cellular Energy Phenotype Test" útfierd dy't levere wurdt troch Seahorse-software (Oanfoljende Fig. 4A-D). Lykas te sjen is yn Oanfoljende Fig. 3B, wiene sawol OCR- as ECAR-metabolyske potinsjes fermindere nei TGF-β1-behanneling, mar der waard gjin ferskil waarnommen yn 'e kombinaasje- en IPA-behannelinggroepen yn ferliking mei de kontrôlegroep. Fierder wiene sawol basale as stressnivo's fan OCR fermindere nei kombinaasje- en IPA-behanneling yn ferliking mei de kontrôlegroep (Oanfoljende Fig. 4C). Nijsgjirrich is dat in ferlykber patroan waarnommen waard mei kombinaasjetherapy, wêrby't gjin feroaring yn basale en stressnivo's fan ECAR waarnommen waard yn ferliking mei TGF-β1-behanneling (Oanfoljende Fig. 4C). Yn HSC's feroare de fermindering fan mitochondriale oksidative fosforylaasje en it fermogen fan kombinaasjebehanneling om SCR en BHI te herstellen nei bleatstelling oan TGF-β1-behanneling it metabolyske potinsjeel net (OCR en ECAR). Tegearre nommen jouwe dizze resultaten oan dat IPA bioenergetika yn HSC's kin ferminderje, wat suggerearret dat IPA in leger enerzjyprofyl kin indusearje dat it HSC-fenotype nei ynaktivaasje ferskowt (Oanfoljende Fig. 4D).
It effekt fan IPA op mitochondriale dynamyk waard ûndersocht mei trijediminsjonale kwantifikaasje fan mitochondriale morfology en netwurkferbiningen, lykas MTR-kleuring (figuer 4 en oanfoljende figuer 5). Figuer 4 lit sjen dat, yn ferliking mei de kontrôlegroep, TGF-β1-behanneling it gemiddelde oerflak, it oantal tûken, de totale tûkelingte en it oantal tûkeferbiningen fermindere (figuer 4A en B) en de proporsje fan mitochondria feroare fan sferyske nei tuskenlizzende morfology (figuer 4C). Allinnich IPA-behanneling fermindere it gemiddelde mitochondriale folume en feroare de proporsje fan mitochondria fan sferyske nei tuskenlizzende morfology yn ferliking mei de kontrôlegroep (figuer 4A). Yn tsjinstelling, bleaune sferisiteit, gemiddelde tûkelingte en mitochondriale aktiviteit beoardiele troch mitochondriale membraanpotinsjaal-ôfhinklike MTR (figuer 4A en E) net feroare en dizze parameters ferskille net tusken groepen. Byinoar nommen suggerearje dizze resultaten dat TGF-β1- en IPA-behanneling de mitochondriale foarm en grutte lykje te modulearjen, lykas netwurkkompleksiteit yn libbene LX-2-sellen.
IPA feroaret mitochondriale dynamyk en mitokondriaal DNA-oerfloed yn LX-2-sellen. A. Represintative konfokale ôfbyldings fan libbene LX-2-sellen ynkubearre mei TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA foar 24 oeren yn serumfrij medium dy't mitochondriale netwurken sjen litte kleurd mei Mitotracker™ Red CMXRos en kearnen kleurd blau mei DAPI. Alle gegevens befette teminsten 15 ôfbyldings per groep. Wy hawwe 10 Z-stack-ôfbyldings krigen foar elk stekproeftype. Elke Z-as-sekwinsje befette 30 plakjes, elk mei in dikte fan 9,86 μm. Skaalbalke: 10 μm. B. Represintative objekten (allinich mitochondria) identifisearre troch adaptive drompelwearde ta te passen op 'e ôfbylding. Kwantitative analyze en fergeliking fan mitochondriale morfologyske netwurkferbiningen waarden útfierd foar alle sellen yn elke groep. C. Frekwinsje fan mitochondriale foarmferhâldingen. Wearden tichtby 0 jouwe sferyske foarmen oan, en wearden tichtby 1 jouwe filamenteuze foarmen oan. D Mitochondriaal DNA (mtDNA) ynhâld waard bepaald lykas beskreaun yn Materialen en Metoaden. E Mitotracker™ Red CMXRos-analyze waard útfierd troch flowcytometry (30.000 eveneminten) lykas beskreaun yn Materialen en Metoaden. Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± SD, n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. Statistyske fergelikingen waarden útfierd mei ienwegs ANOVA en Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Wy hawwe doe it mtDNA-gehalte yn LX-2-sellen analysearre as in yndikator fan it oantal mitochondria. Yn ferliking mei de kontrôlegroep wie it mtDNA-gehalte ferhege yn 'e mei TGF-β1 behannele groep (figuer 4D). Yn ferliking mei de mei TGF-β1 behannele groep wie it mtDNA-gehalte fermindere yn 'e kombinaasjebehannelinggroep (figuer 4D), wat suggerearret dat IPA it mtDNA-gehalte en mooglik it oantal mitochondria, lykas mitochondriale respiraasje, kin ferminderje (figuer 3C). Boppedat like IPA it mtDNA-gehalte yn 'e kombinaasjebehanneling te ferminderjen, mar hie gjin ynfloed op MTR-bemiddelde mitochondriale aktiviteit (figueren 4A-C).
Wy ûndersochten de assosjaasje fan IPA mei de mRNA-nivo's fan genen dy't ferbûn binne mei fibrose, apoptose, oerlibjen en mitochondriale dynamyk yn LX-2-sellen (figuer 5A-D). Yn ferliking mei de kontrôlegroep liet de mei TGF-β1 behannele groep ferhege ekspresje sjen fan genen lykas kollageen type I α2-keten (COL1A2), α-glêde spieraktine (αSMA), matrixmetalloproteinase 2 (MMP2), weefselremmer fan metalloproteinase 1 (TIMP1), en dynamin 1-like gen (DRP1), wat oanjout op ferhege fibrose en aktivearring. Fierder, yn ferliking mei de kontrôlegroep, fermindere TGF-β1-behanneling de mRNA-nivo's fan nukleêre pregnane X-reseptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, remmer fan B-sel α, enhancer fan nukleêre faktor κ-gen ljochtpeptide (NFκB1A), en remmer fan nukleêre faktor κB-kinase-subunit β (IKBKB) (figuer 5A-D). Yn ferliking mei TGF-β1-behanneling fermindere kombinaasjebehanneling mei TGF-β1 en IPA de ekspresje fan COL1A2 en MMP2, mar ferhege de mRNA-nivo's fan PXR, TIMP1, B-sel lymfoom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, en IKBKB. IPA-behanneling fermindere signifikant de ekspresje fan MMP2, Bcl-2-assosjeare proteïne X (BAX), AKT1, optyske atrofyproteïne 1 (OPA1), en mitochondriale fúzjeproteïne 2 (MFN2), wylst de ekspresje fan CASP8, NFκB1A, NFκB1B, en IKBKB ferhege wie yn ferliking mei de kontrôlegroep. Der waard lykwols gjin ferskil fûn yn 'e ekspresje fan caspase-3 (CASP3), apoptyske peptidase-aktivearjende faktor 1 (APAF1), mitochondriale fúzjeproteïne 1 (MFN1), en fissyproteïne 1 (FIS1). Kollektyf suggerearje dizze resultaten dat IPA-behanneling de ekspresje fan genen modulearret dy't ferbûn binne mei fibrose, apoptose, oerlibjen en mitochondriale dynamyk. Us gegevens suggerearje dat IPA-behanneling fibrose yn LX-2-sellen ferminderet; tagelyk stimulearret it oerlibjen troch it fenotype te ferskowen nei ynaktivaasje.
IPA modulearret de ekspresje fan fibroblast-, apoptotyske, libbensfetberens- en mitochondriale dynamykgenen yn LX-2-sellen. Histogrammen litte mRNA-ekspresje sjen relatyf oan endogene kontrôle (RPLP0 of PPIA) nei't LX-2-sellen 24 oeren lang ynducearre binne mei TGF-β1 en IPA yn serumfrij medium. A jout fibroblasten oan, B jout apoptotyske sellen oan, C jout oerlibjende sellen oan, en D jout mitochondriale dynamykgenekspresje oan. Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± standertôfwiking (SD), n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. Statistyske fergelikingen waarden útfierd mei ienwegs ANOVA en Bonferroni post hoc-test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Doe waarden feroarings yn selgrutte (FSC-H) en cytoplasmatyske kompleksiteit (SSC-H) beoardiele troch flowcytometry (Ofbylding 6A, B), en feroarings yn selmorfology nei IPA-behanneling waarden beoardiele troch transmissie-elektronenmikroskopie (TEM) en fazekontrastmikroskopie (Oanfoljende Figuer 6A-B). Lykas ferwachte, namen sellen yn 'e mei TGF-β1 behannele groep yn grutte ta yn ferliking mei de kontrôlegroep (Ofbylding 6A, B), wat de klassike útwreiding fan rûch endoplasmatysk reticulum (ER*) en fagolysosomen (P) sjen lit, wat oanjout op hematopoëtyske stamsel (HSC) aktivearring (Oanfoljende Figuer 6A). Yn ferliking mei de mei TGF-β1 behannele groep wiene de selgrutte, cytoplasmatyske kompleksiteit (Ofbylding 6A, B) en ER*-ynhâld lykwols fermindere yn 'e TGF-β1 en IPA kombinaasjebehannelinggroep (Oanfoljende Figuer 6A). Fierder fermindere IPA-behanneling de selgrutte, cytoplasmatyske kompleksiteit (Ofbyldings 6A, B), P en ER*-ynhâld (Oanfoljende Figuer 6A) yn ferliking mei de kontrôlegroep. Derneist naam it gehalte oan apoptotyske sellen ta nei 24 oeren IPA-behanneling yn ferliking mei de kontrôlegroep (wite pylken, Oanfoljende Fig. 6B). Kollektyf suggerearje dizze resultaten dat 1 mM IPA HSC-apoptose kin stimulearje en de feroaringen yn selmorfologyske parameters dy't troch TGF-β1 feroarsake wurde, omkeare kin, wêrtroch't de selgrutte en kompleksiteit regele wurde kinne, wat mooglik assosjeare wurde kin mei HSC-inaktivaasje.
IPA feroaret selgrutte en cytoplasmatyske kompleksiteit yn LX-2-sellen. Represintative ôfbyldings fan flowcytometry-analyze. De analyze brûkte in gatingstrategy spesifyk foar LX-2-sellen: SSC-A/FSC-A om de selpopulaasje te definiearjen, FSC-H/FSC-A om dûbeltsjes te identifisearjen, en SSC-H/FSC-H foar selgrutte- en kompleksiteitsanalyze. Sellen waarden 24 oeren ynkubearre mei TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA yn serumfrij medium. LX-2-sellen waarden ferdield yn it ûnderste linker kwadrant (SSC-H-/FSC-H-), boppe linker kwadrant (SSC-H+/FSC-H-), ûnderste rjochter kwadrant (SSC-H-/FSC-H+), en boppe rjochter kwadrant (SSC-H+/FSC-H+) foar selgrutte- en cytoplasmatyske kompleksiteitsanalyze. B. Selmorfology waard analysearre troch flowcytometry mei FSC-H (foarútfersprieding, selgrutte) en SSC-H (sydfersprieding, cytoplasmatyske kompleksiteit) (30.000 eveneminten). Gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± SD, n = 3 ûnôfhinklike eksperiminten. Statistyske fergelikingen waarden útfierd mei ienwegs ANOVA en Bonferroni post hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 en ****p < 0.0001
Darmmetaboliten lykas IPA binne in hjit ûnderwerp fan ûndersyk wurden, wat suggerearret dat nije doelen ûntdutsen wurde kinne yn 'e darmflora. It is dêrom nijsgjirrich dat IPA, in metaboliet dy't wy keppele hawwe oan leverfibrose by minsken [15], oantoand is as in potinsjele antifibroatyske ferbining yn diermodellen [13, 14]. Hjir demonstrearje wy foar it earst in assosjaasje tusken serum IPA en globale levertranskriptomika en DNA-metylaasje by obese persoanen sûnder type 2-diabetes (T2D), wêrby't apoptose, mitofagy en longevity markearre wurde, lykas in mooglik kandidaatgen AKT1 dat leverhomeostase regulearret. In oare nijichheid fan ús stúdzje is dat wy de ynteraksje fan IPA-behanneling mei apoptose, selmorfology, mitochondriale bioenergetika en dynamyk yn LX-2-sellen demonstrearre hawwe, wat in leger enerzjyspektrum oanjout dat it HSC-fenotype nei ynaktivaasje ferskowt, wêrtroch IPA in potinsjele kandidaat is foar it ferbetterjen fan leverfibrose.
Wy fûnen dat apoptose, mitofagy en longevity de wichtichste kanonike paden wiene dy't ferrike wiene mei levergenen dy't ferbûn binne mei sirkulearjend serum IPA. Fersteuring fan it mitochondriale kwaliteitskontrôlesysteem (MQC) kin liede ta mitochondriale dysfunksje, mitofagy en apoptose, wêrtroch it foarkommen fan MASLD befoardere wurdt [33, 34]. Dêrom kinne wy ​​spekulearje dat IPA belutsen wêze kin by it behâld fan seldynamyk en mitochondriale yntegriteit fia apoptose, mitofagy en longevity yn 'e lever. Us gegevens lieten sjen dat twa genen mienskiplik wiene yn 'e trije assays: YKT6 en AKT1. It is it neamen wurdich dat YKT6 in SNARE-proteïne is dy't belutsen is by it proses fan selmembraanfúzje. It spilet in rol yn autofagy en mitofagy troch in inisjatyfkompleks te foarmjen mei STX17 en SNAP29 op it autofagosom, wêrtroch de fúzje fan autofagosomen en lysosomen befoardere wurdt [35]. Fierder resultearret ferlies fan YKT6-funksje yn beheinde mitofagy[36], wylst opregulearring fan YKT6 assosjeare wurdt mei de foarútgong fan hepatocellulêr karsinoom (HCC), wat in ferhege sel-oerlibjen sjen lit[37]. Oan 'e oare kant is AKT1 it wichtichste ynteraksjegen en spilet in wichtige rol yn leversykten, ynklusyf de PI3K/AKT-sinjalearingsrûte, selsyklus, selmigraasje, proliferaasje, fokale adhesion, mitochondriale funksje en kollageensekresje[38–40]. Aktivearre PI3K/AKT-sinjalearingsrûte kin hematopoëtyske stamsellen (HSC's) aktivearje, dy't de sellen binne dy't ferantwurdlik binne foar de produksje fan ekstrasellulêre matrix (ECM), en har dysregulearring kin bydrage oan it foarkommen en de foarútgong fan leverfibrose[40]. Derneist is AKT ien fan 'e wichtichste sel-oerlibjensfaktoaren dy't p53-ôfhinklike sel-apoptose remt, en AKT-aktivearring kin assosjeare wurde mei de ynhibysje fan leversel-apoptose[41, 42]. De krigen resultaten suggerearje dat IPA belutsen kin wêze by levermitochondria-assosjeare apoptose troch ynfloed te hawwen op 'e beslút fan hepatocyten tusken it yngean fan apoptose of oerlibjen. Dizze effekten kinne wurde regele troch AKT- en/of YKT6-kandidaatgenen, dy't kritysk binne foar leverhomeostase.
Us resultaten lieten sjen dat 1 mM IPA apoptose feroarsake en mitochondriale respiraasje yn LX-2-sellen fermindere, ûnôfhinklik fan TGF-β1-behanneling. It is opmerklik dat apoptose in wichtige paad is foar fibrose-resolúsje en hematopoëtyske stamsel (HSC)-aktivaasje, en ek in wichtige barren is yn 'e omkearbere fysiologyske reaksje fan leverfibrose [4, 43]. Boppedat joech it herstel fan BHI yn LX-2-sellen nei kombinaasjebehanneling nije ynsjoggen yn 'e potinsjele rol fan IPA yn' e regeling fan mitochondriale bioenergetika. Under rêstende en ynaktive omstannichheden brûke hematopoëtyske sellen normaal mitochondriale oksidative fosforylaasje om ATP te produsearjen en hawwe se in lege metabolike aktiviteit. Oan 'e oare kant ferbetteret HSC-aktivaasje mitochondriale respiraasje en biosynteze om te kompensearjen foar de enerzjybehoeften fan it yngean fan 'e glykolytyske steat [44]. It feit dat IPA gjin ynfloed hie op it metabolike potinsjeel en ECAR suggerearret dat it glykolytyske paad minder prioriteit hat. Op deselde wize liet in oare stúdzje sjen dat 1 mM IPA yn steat wie om mitochondriale respiratoire ketenaktiviteit te modulearjen yn kardiomyocyten, minsklike hepatocyte-selline (Huh7) en minsklike navelstreng-endotheelzellen (HUVEC); Der waard lykwols gjin effekt fan IPA fûn op glykolyse yn kardiomyocyten, wat suggerearret dat IPA de bioenergetika fan oare seltypen kin beynfloedzje [45]. Dêrom spekulearje wy dat 1 mM IPA kin fungearje as in mylde gemyske ûntkoppelaar, om't it fibrogene genekspresje, selmorfology en mitochondriale bioenergetika signifikant kin ferminderje sûnder de hoemannichte mtDNA te feroarjen [46]. Mitochondriale ûntkoppelaars kinne kultuer-induzearre fibrose en HSC-aktivaasje remme [47] en mitochondriale ATP-produksje ferminderje dy't regele of ynducearre wurdt troch bepaalde proteïnen lykas ûntkoppelproteïnen (UCP) of adenine nukleotide translocase (ANT). Ofhinklik fan it seltype kin dit ferskynsel sellen beskermje tsjin apoptose en/of apoptose befoarderje [46]. Fierdere stúdzjes binne lykwols nedich om de rol fan IPA as in mitochondriale ûntkoppelaar by hematopoëtyske stamselinaktivaasje te ferdúdlikjen.
Wy hawwe doe ûndersocht oft de feroaringen yn mitochondriale respiraasje wjerspegele wurde yn mitochondriale morfology yn libbene LX-2-sellen. Nijsgjirrich is dat TGF-β1-behanneling de mitochondriale proporsje feroaret fan sferysk nei tuskenfoarmich, mei fermindere mitochondriale fertakking en ferhege ekspresje fan DRP1, in kaaifaktor yn mitochondriale fisy [48]. Fierder is mitochondriale fragmintaasje assosjeare mei algemiene netwurkkompleksiteit, en de oergong fan fúzje nei fisy is kritysk foar hematopoëtyske stamsel (HSC) aktivearring, wylst ynhibysje fan mitochondriale fisy liedt ta HSC-apoptose [49]. Sa jouwe ús resultaten oan dat TGF-β1-behanneling in ôfname yn mitochondriale netwurkkompleksiteit kin feroarsaakje mei fermindere fertakking, wat faker foarkomt yn mitochondriale fisy assosjeare mei aktivearre hematopoëtyske stamsellen (HSC's). Fierder lieten ús gegevens sjen dat IPA de proporsje fan mitochondria koe feroarje fan sferyske nei tuskenfoarmige foarm, wêrtroch de ekspresje fan OPA1 en MFN2 ferminderet. Undersyk hat oantoand dat delregeling fan OPA1 in ôfname yn mitochondriale membraanpotinsjeel kin feroarsaakje en sel-apoptose kin triggerje [50]. MFN2 is bekend om mitochondriale fúzje en apoptose te bemiddeljen [51]. De krigen resultaten suggerearje dat ynduksje fan LX-2-sellen troch TGF-β1 en/of IPA de mitochondriale foarm en grutte liket te modulearjen, lykas de aktivearringssteat en netwurkkompleksiteit.
Us resultaten jouwe oan dat de kombinaasjebehanneling fan TGFβ-1 en IPA mtDNA en selmorfologyske parameters koe ferminderje troch de mRNA-ekspresje fan fibrose, apoptose en oerlibjensrelatearre genen yn apoptose-ûntwykende sellen te regeljen. Yndied, IPA ferlege it mRNA-ekspresjenivo fan AKT1 en wichtige fibrosegenen lykas COL1A2 en MMP2, mar ferhege it ekspresjenivo fan CASP8, dat assosjeare wurdt mei apoptose. Us resultaten lieten sjen dat nei IPA-behanneling de BAX-ekspresje ôfnaam en de mRNA-ekspresje fan TIMP1-famylje-subeenheden, BCL-2 en NF-κB tanommen, wat suggerearret dat IPA oerlibjenssignalen koe stimulearje yn hematopoëtyske stamsellen (HSC's) dy't apoptose ûntwike. Dizze molekulen kinne fungearje as pro-oerlibjenssignalen yn aktivearre hematopoëtyske stamsellen, dy't kinne wurde assosjeare mei ferhege ekspresje fan anti-apoptotyske proteïnen (lykas Bcl-2), fermindere ekspresje fan pro-apoptotyske BAX, en in komplekse ynteraksje tusken TIMP en NF-κB [5, 7]. IPA oefenet syn effekten út fia PXR, en wy fûnen dat kombinaasjebehanneling mei TGF-β1 en IPA de PXR mRNA-ekspresjenivo's ferhege, wat oanjout op ûnderdrukking fan HSC-aktivaasje. Aktivearre PXR-sinjalearring is bekend om HSC-aktivaasje sawol yn vivo as yn vitro te remmen [52, 53]. Us resultaten jouwe oan dat IPA kin meidwaan oan 'e klaring fan aktivearre HSC's troch apoptose te befoarderjen, fibrose en mitochondriale metabolisme te ferminderjen, en oerlibingssignalen te ferbetterjen, wat typyske prosessen binne dy't it aktivearre HSC-fenotype omsette yn in ynaktivearre. In oare mooglike ferklearring foar it potinsjele meganisme en de rol fan IPA yn apoptose is dat it dysfunksjonele mitochondria primêr opfangt fia mitofagy (yntrinsyk paad) en it ekstrinsyke TNF-sinjalearingspaad (Tabel 1), dat direkt keppele is oan it NF-κB-oerlibingssinjalearingspaad (Oanfoljende figuer 7). Nijsgjirrich is dat IPA-relatearre ferrike genen yn steat binne om pro-apoptotyske en pro-oerlibingssignalen te indusearjen yn it apoptotyske paad [54], wat suggerearret dat IPA it apoptotyske paad of oerlibjen kin indusearje troch ynteraksje mei dizze genen. Hoe't IPA apoptose of oerlibjen ynducearret tidens HSC-aktivearring en de mechanistyske paden dêrfan bliuwe lykwols ûndúdlik.
IPA is in mikrobiële metaboliet dy't foarme wurdt út tryptofaan yn 'e darmflora. Undersyk hat oantoand dat it anty-inflammatoare, antioxidante en epigenetyske regeljouwende eigenskippen hat yn 'e intestinale omjouwing.[55] Undersyk hat oantoand dat IPA de intestinale barriêrefunksje modulearje kin en oksidative stress ferminderje kin, wat kin bydrage oan syn lokale fysiologyske effekten.[56] Eins wurdt IPA fia de sirkulaasje nei doelorganen ferfierd, en om't IPA in ferlykbere haadmetabolietstruktuer dielt mei tryptofaan, serotonine en indoolderivaten, oefenet IPA metabolike aksjes út dy't resultearje yn kompetitive metabolike bestimmingen.[52] IPA kin konkurrearje mei fan tryptofaan ôflaatte metaboliten foar bindingsplakken op enzymen of reseptors, wêrtroch't normale metabolike paden mooglik fersteure wurde. Dit ûnderstreket de needsaak foar fierdere stúdzjes oer syn farmakokinetika en farmakodynamika om syn terapeutyske finster better te begripen.[57] It bliuwt te sjen oft dit ek kin foarkomme yn hematopoëtyske stamsellen (HSC's).
Wy erkenne dat ús stúdzje wat beheiningen hat. Om spesifyk assosjaasjes relatearre oan IPA te ûndersiikjen, hawwe wy pasjinten mei type 2-diabetes mellitus (T2DM) útsletten. Wy erkenne dat dit de brede tapassing fan ús befiningen beheint op pasjinten mei type 2-diabetes mellitus en avansearre leversykte. Hoewol de fysiologyske konsintraasje fan IPA yn minsklik serum 1-10 μM is [11, 20], waard in konsintraasje fan 1 mM IPA keazen op basis fan 'e heechste net-giftige konsintraasje [15] en it heechste taryf fan apoptose, sûnder ferskil yn it persintaazje fan 'e nekrotyske selpopulaasje. Hoewol suprafysiologyske nivo's fan IPA waarden brûkt yn dizze stúdzje, is d'r op it stuit gjin konsensus oer de effektive doasis fan IPA [52]. Hoewol ús resultaten signifikant binne, bliuwt it bredere metabolike lot fan IPA in aktyf ûndersyksgebiet. Boppedat waarden ús befiningen oer de assosjaasje tusken serum IPA-nivo's en DNA-metylaasje fan levertranskripten net allinich krigen fan hematopoëtyske stamsellen (HSC's), mar ek fan leverweefsels. Wy hawwe keazen om minsklike LX-2-sellen te brûken op basis fan ús eardere befiningen út transkriptome-analyze dat IPA assosjeare is mei hematopoëtyske stamsel (HSC)-aktivaasje [15], en HSC's binne de wichtichste sellen dy't belutsen binne by de foarútgong fan leverfibrose. De lever bestiet út meardere seltypen, dus oare selmodellen lykas it hepatocyte-HSC-ymmúnsel-ko-kultuersysteem yn kombinaasje mei caspase-aktivaasje en DNA-fragmentaasje, lykas it wurkingsmeganisme ynklusyf proteïnenivo, moatte wurde beskôge om de rol fan IPA en syn ynteraksje mei oare leverseltypen te bestudearjen.