Ferskillende teoryen foar plantferdigening jouwe wichtige teoretyske begelieding foar it ferklearjen fan 'e patroanen fan plantspesjalisearre metabolisme, mar har wichtichste foarsizzingen moatte noch wurde hifke. Hjir hawwe wy ûnpartidige tandem-massaspektrometry (MS/MS)-analyze brûkt om systematysk it metaboloom fan tabakferswakke stammen te ûndersiikjen fan yndividuele planten oant populaasjes en nau besibbe soarten, en in grut oantal massaspektrometryske funksjeteoryen ferwurke basearre op gearstalde spektra yn 'e ynformaasje. Ramt om de wichtichste foarsizzingen fan optimale ferdigening (OD) en bewegende doelen (MT) teoryen te testen. De ynformaasjekomponint fan plantmetabolomika is yn oerienstimming mei de OD-teory, mar tsjinsprekt de wichtichste foarsizzing fan MT-teory oer metabolomika-dynamika feroarsake troch herbivoaren. Fan 'e mikro- oant de makro-evolúsjonêre skaal waard it jasmonaatsignaal identifisearre as de wichtichste determinant fan OD, wylst it etyleensignaal fynôfstimming levere fan 'e herbivoar-spesifike respons annotearre troch it MS/MS molekulêre netwurk.
Spesjale metaboliten mei ferskate struktueren binne de wichtichste dielnimmers yn plantoanpassing oan 'e omjouwing, benammen yn 'e ferdigening fan fijannen (1). De geweldige diversifikaasje fan it spesjale metabolisme dat fûn wurdt yn planten hat tsientallen jierren fan yngeand ûndersyk stimulearre nei syn protte aspekten fan ekologyske funksjes, en hat in lange list mei plantferdigeningsteoryen foarme, dy't de evolúsjonêre en ekologyske ûntwikkeling fan plant-ynsekt-ynteraksjes binne. Empirysk ûndersyk jout wichtige begelieding (2). Dizze plantferdigeningsteoryen folgen lykwols net it normatyf paad fan hypotetyske deduktive redenearring, wêryn wichtige foarsizzingen op itselde nivo fan analyze wiene (3) en eksperiminteel testen waarden om de folgjende syklus fan teoretyske ûntwikkeling foarút te helpen (4). Technyske beheiningen beheine gegevensferzameling ta spesifike metabolike kategoryen en slute wiidweidige analyze fan spesjalisearre metaboliten út, wêrtroch fergelikingen tusken kategoryen dy't essensjeel binne foar teoretyske ûntwikkeling foarkommen wurde (5). It gebrek oan wiidweidige metabolomika-gegevens en in mienskiplike munt om de ferwurkingsworkflow fan 'e metabolike romte tusken ferskate plantgroepen te fergelykjen hinderet de wittenskiplike folwoeksenheid fan it fjild.
De lêste ûntjouwings op it mêd fan tandem-massaspektrometry (MS/MS) metabolomika kinne de metabolike feroarings binnen en tusken soarten fan in bepaalde systeemklade wiidweidich karakterisearje, en kinne wurde kombineare mei berekkeningsmetoaden om de strukturele oerienkomst tusken dizze komplekse mingsels te berekkenjen. Foarôfgeande kennis fan skiekunde (5). De kombinaasje fan avansearre technologyen yn analyze en kompjûterjen leveret in needsaaklik ramt foar lange-termyn testen fan in protte foarsizzingen makke troch de ekologyske en evolúsjonêre teoryen fan metabolike ferskaat. Shannon (6) yntrodusearre ynformaasjeteory foar it earst yn syn baanbrekkende artikel yn 1948, en lei de basis foar de wiskundige analyze fan ynformaasje, dy't yn in protte oare fjilden as de oarspronklike tapassing brûkt is. Yn genomika is ynformaasjeteory mei súkses tapast om sekwinsjekonservative ynformaasje te kwantifisearjen (7). Yn transkriptomika-ûndersyk analysearret ynformaasjeteory de algemiene feroarings yn it transkriptoom (8). Yn earder ûndersyk hawwe wy it statistyske ramt fan ynformaasjeteory tapast op metabolomika om de metabolike ekspertize fan it weefselnivo yn planten te beskriuwen (9). Hjir kombinearje wy de MS/MS-basearre workflow mei it statistyske ramt fan ynformaasjeteory, karakterisearre troch de metabolike ferskaat yn 'e mienskiplike munt, om de wichtichste foarsizzingen fan 'e plantferdigeningsteory fan it metaboloom feroarsake troch herbivoren te fergelykjen.
De teoretyske kaders fan plantferdigening binne meastentiids ûnderling ynklusyf en kinne wurde ferdield yn twa kategoryen: dyjingen dy't besykje de ferdieling fan plantspesifike metaboliten te ferklearjen op basis fan ferdigeningsfunksjes, lykas optimale ferdigening (OD) (10), bewegend doel (MT) (11) en uterlik (12) teory, wylst oaren meganyske ferklearrings sykje oer hoe't feroarings yn beskikberens fan boarnen ynfloed hawwe op plantgroei en de opgarjen fan spesjalisearre metaboliten, lykas koalstof: fiedingsbalânshypotese (13), groeisnelheidhypotese (14), en de groei- en differinsjaasje-lykwichtshypotese (15). De twa sets teoryen binne op ferskillende nivo's fan analyze (4). Twa teoryen dy't ferdigeningsfunksjes op funksjoneel nivo omfetsje, dominearje lykwols it petear oer konstitutive en ynducearbere ferdigenings fan planten: OD-teory, dy't oannimt dat planten allinich ynvestearje yn har djoere gemyske ferdigenings as it nedich is, bygelyks as se ynnommen wurde. As in gersdier oanfalt, wurdt dêrom, neffens de mooglikheid fan in takomstige oanfal, de ferbining mei in ferdigeningsfunksje tawiisd (10); De MT-hypotese stelt dat der gjin as is fan rjochtingferoaring fan metaboliten, mar dat de metaboliet willekeurich feroaret, wêrtroch't de mooglikheid ûntstiet dat it metabolike "bewegingsdoel" fan oanfallende herbivoaren hinderet. Mei oare wurden, dizze twa teoryen dogge tsjinoerstelde foarsizzingen oer de metabolike ferbouwing dy't optreedt nei de oanfal fan herbivoaren: de relaasje tusken de unidireksjonele opgarjen fan metaboliten mei ferdigeningsfunksje (OD) en net-rjochte metabolike feroarings (MT) (11).
De OD- en MT-hypotezen omfetsje net allinich de feroarsake feroarings yn it metaboloom, mar ek de ekologyske en evolúsjonêre gefolgen fan 'e opgarjen fan dizze metaboliten, lykas de adaptive kosten en foardielen fan dizze metabolike feroarings yn in spesifike ekologyske omjouwing (16). Hoewol beide hypotezen de ferdigeningsfunksje fan spesjalisearre metaboliten erkenne, dy't al of net djoer kinne wêze, leit de wichtichste foarsizzing dy't de OD- en MT-hypotezen ûnderskiedt yn 'e rjochting fan' e feroarsake metabolike feroarings. De foarsizzing fan 'e OD-teory hat oant no ta de measte eksperimintele oandacht krigen. Dizze testen omfetsje de stúdzje fan 'e direkte of yndirekte ferdigeningsfunksjes fan ferskate weefsels fan spesifike ferbiningen yn kassen en natuerlike omstannichheden, lykas feroarings yn it stadium fan plantûntwikkeling (17-19). Oant no ta, troch it ûntbrekken fan in workflow en statistysk ramt foar wrâldwide wiidweidige analyze fan metabolike ferskaat fan elk organisme, moat de wichtichste ferskilfoarsizzing tusken de twa teoryen (dat is, de rjochting fan metabolike feroarings) noch hifke wurde. Hjir leverje wy sa'n analyze.
Ien fan 'e wichtichste skaaimerken fan plantspesifike metaboliten is har ekstreme strukturele ferskaat op alle nivo's fan ienkele planten, populaasjes oant ferlykbere soarten (20). In protte kwantitative feroarings yn spesjalisearre metaboliten kinne wurde waarnommen op populaasjeskaal, wylst sterke kwalitative ferskillen meastentiids wurde hanthavene op soartenivo (20). Dêrom is plantmetabolismeferskaat it wichtichste aspekt fan funksjonele ferskaat, wat de oanpassingsfermogen oan ferskate nissen reflektearret, foaral dy nissen mei ferskillende ynvaazjemooglikheden troch spesjale ynsekten en gewoane herbivoaren (21). Sûnt Fraenkel's (22) baanbrekkende artikel oer de redenen foar it bestean fan plantspesifike metaboliten, binne ynteraksjes mei ferskate ynsekten beskôge as wichtige seleksjedruk, en dizze ynteraksjes wurde leaud planten tidens evolúsje foarme te hawwen. Metabolismepaad (23). Yntersoarteferskillen yn 'e ferskaat fan spesjalisearre metaboliten kinne ek it fysiologyske lykwicht reflektearje dat ferbûn is mei konstitutive en ynducearbere plantferdigening tsjin herbivoare strategyen, om't de twa soarten faak negatyf mei elkoar korreleare binne (24). Hoewol it foardielich wêze kin om altyd in goede ferdigening te behâlden, jouwe tydlike metabolike feroarings dy't ferbûn binne mei ferdigening dúdlike foardielen, om't planten weardefolle boarnen kinne tawize oan oare fysiologyske ynvestearrings (19, 24), en de needsaak foar symbioaze foarkomme. Kollaterale skea (25). Derneist kinne dizze reorganisaasjes fan spesjalisearre metaboliten feroarsake troch ynsektenherbivoaren liede ta destruktive fersprieding yn 'e populaasje (26), en kinne se direkte lêzingen reflektearje fan substansjele natuerlike feroarings yn it jasmonzuur (JA) sinjaal, dat yn 'e populaasje kin wurde behâlden. Hege en lege JA-sinjalen binne ôfwagings tusken ferdigening tsjin herbivoaren en konkurrinsje mei spesifike soarten (27). Derneist sille spesjalisearre metabolietbiosyntetyske paden rap ferlies en transformaasje ûndergean tidens evolúsje, wat resulteart yn ûngelikense metabolike fersprieding tusken nau besibbe soarten (28). Dizze polymorfismen kinne rap fêststeld wurde yn reaksje op feroarjende herbivoarpatroanen (29), wat betsjut dat de fluktuaasje fan herbivoarmienskippen in wichtige faktor is dy't metabolike heterogeniteit oandriuwt.
Hjir hawwe wy spesifyk de folgjende problemen oplost. (I) Hoe konfigurearret it herbivoare ynsekt it plantmetaboloom opnij? (Ii) Wat binne de wichtichste ynformaasjekomponinten fan metabolike plastisiteit dy't kwantifisearre wurde kinne om de foarsizzingen fan 'e lange-termyn ferdigeningsteory te testen? (Iii) Oft it plantmetaboloom opnij programmearre wurde moat op in manier dy't unyk is foar de oanfaller, as dat sa is, hokker rol spilet plantehormoan by it oanpassen fan in spesifike metabolike reaksje, en hokker metaboliten drage by oan 'e soartespesifisiteit fan ferdigening? (Iv) Om't de foarsizzingen dy't makke wurde troch in protte ferdigeningsteoryen útwreide wurde kinne oer alle nivo's fan biologyske weefsels, hawwe wy frege hoe konsekwint de feroarsake metabolike reaksje is fan ynterne fergeliking oant yntersoartefergeliking? Hjirfoar hawwe wy systematysk it blêdmetaboloom fan tabaknikotine bestudearre, dat in ekologyske modelplant is mei in rike spesjalisearre metabolisme, en effektyf is tsjin de larven fan twa ynheemse herbivoaren, Lepidoptera Datura (Ms) (Hiel agressyf, benammen iten). Op Solanaceae en Spodoptera littoralis (Sl) binne katoenen blêdwjirms in soarte fan "geslacht", mei de gasthearplanten fan Solanaceae en oare gastheren fan oare geslachten en famyljes Plant iten. Wy hawwe it MS/MS metabolomika-spektrum analysearre en statistyske deskriptoren fan 'e ynformaasjeteory ekstrahearre om OD- en MT-teoryen te fergelykjen. Spesifisiteitskaarten meitsje om de identiteit fan wichtige metaboliten te iepenbierjen. De analyze waard útwreide nei de ynheemse populaasje fan N. nasi en nau besibbe tabakssoarten om de kovariansje tusken planthormoansignalisaasje en OD-ynduksje fierder te analysearjen.
Om in algemiene kaart te meitsjen oer de plastisiteit en struktuer fan it blêdmetaboloom fan herbivoar tabak, hawwe wy in earder ûntwikkele analyse- en berekkeningsworkflow brûkt om wiidweidich hege-resolúsje gegevens te sammeljen en te dekonvolutearjen, ûnôfhinklike MS/MS-spektra fan plantenekstrakten (9). Dizze ûndifferinsjearre metoade (neamd MS/MS) kin net-redundante ferbiningsspektra konstruearje, dy't dan brûkt wurde kinne foar alle hjir beskreaun analyses op ferbiningsnivo. Dizze dekonvolutearre plantmetaboliten binne fan ferskate soarten, besteande út hûnderten oant tûzenen metaboliten (sawat 500-1000-s/MS/MS hjir). Hjir beskôgje wy metabolike plastisiteit yn it ramt fan ynformaasjeteory, en kwantifisearje de ferskaat en profesjonaliteit fan it metaboloom basearre op 'e Shannon-entropie fan' e metabolike frekwinsjeferdieling. Mei help fan 'e earder ymplementearre formule (8) hawwe wy in set yndikatoaren berekkene dy't brûkt wurde kinne om metaboloomferskaat (Hj-yndikator), metabolike profylspesjalisaasje (δj-yndikator) en metabolike spesifisiteit fan in inkele metaboliet (Si-yndikator) te kwantifisearjen. Derneist hawwe wy de Relative Distance Plasticity Index (RDPI) tapast om de metaboloom-yndusearberens fan herbivoaren te kwantifisearjen (figuer 1A) (30). Binnen dit statistyske ramt behannelje wy it MS/MS-spektrum as de basisynformaasje-ienheid, en ferwurkje de relative oerfloed fan MS/MS yn in frekwinsjeferdielingskaart, en brûke dan Shannon-entropie om de metaboloomferskaat derút te skatten. De metaboloomspesjalisaasje wurdt metten troch de gemiddelde spesifisiteit fan in inkele MS/MS-spektrum. Dêrom wurdt de tanimming fan 'e oerfloed fan guon MS/MS-klassen nei herbivoar-ynduksje omfoarme ta spektrale yndusearberens, RDPI en spesjalisaasje, dat is, de tanimming fan 'e δj-yndeks, om't mear spesjalisearre metaboliten produsearre wurde en in hege Si-yndeks produsearre wurdt. De ferleeging fan 'e Hj-ferskaatsyndeks reflektearret dat of it oantal generearre MS/MS wurdt fermindere, of de profylfrekwinsjeferdieling feroaret yn in minder unifoarme rjochting, wylst de algemiene ûnwissichheid wurdt fermindere. Troch de Si-yndeksberekkening is it mooglik om te markearjen hokker MS/MS troch bepaalde herbivoaren feroarsake wurde, krekt oarsom, hokker MS/MS net reagearret op 'e ynduksje, wat in wichtige yndikator is om MT- en OD-foarsizzing te ûnderskieden.
(A) Statistyske deskriptoren brûkt foar herbivoar (H1 oant Hx) MS/MS-data-inducibiliteit (RDPI), ferskaat (Hj-yndeks), spesjalisaasje (δj-yndeks) en metabolietspesifisiteit (Si-yndeks). In tanimming fan 'e mjitte fan spesjalisaasje (δj) jout oan dat der gemiddeld mear herbivoar spesifike metaboliten produsearre wurde, wylst in ôfname yn ferskaat (Hj) in ôfname yn 'e produksje fan metaboliten of in ûngelikense ferdieling fan metaboliten yn 'e ferdielingskaart oanjout. De Si-wearde beoardielet oft de metaboliet spesifyk is foar in bepaalde tastân (hjir herbivoar) of oarsom op itselde nivo hâlden wurdt. (B) Konseptueel diagram fan ferdigeningsteoryfoarsizzing mei help fan ynformaasjeteory-as. OD-teory foarseit dat herbivoaroanfal de ferdigeningmetaboliten sil ferheegje, wêrtroch δj tanimt. Tagelyk nimt Hj ôf, om't it profyl reorganisearre wurdt nei de fermindere ûnwissichheid fan metabolike ynformaasje. De MT-teory foarseit dat de oanfal fan herbivoaren net-rjochtingferoarings yn it metaboloom sil feroarsaakje, wêrtroch Hj tanimt as in yndikator fan ferhege metabolike ynformaasje-ûnwissichheid en in willekeurige ferdieling fan Si feroarsaket. Wy hawwe ek in mingd model foarsteld, de bêste MT, wêryn guon metaboliten mei hegere ferdigeningswearden benammen ferhege wurde sille (hege Si-wearde), wylst oaren willekeurige reaksjes sjen litte (legere Si-wearde).
Mei help fan ynformaasjeteory-deskriptoren ynterpretearje wy de OD-teory om te foarsizzen dat herbivoar-induzearre spesjale metabolietferoarings yn in net-induzearre konstitutive steat sille liede ta (i) in tanimming fan metabolike spesifisiteit (Si-yndeks) dy't metabonomyske spesifisiteit (δj-yndeks) oandriuwt. De tanimming fan bepaalde spesjale metabolietgroepen mei hegere ferdigeningswearde, en (ii) de ôfname fan metaboloomferskaat (Hj-yndeks) fanwegen de feroaring fan metabolike frekwinsjeferdieling nei mear leptine-lichemsferdieling. Op it nivo fan in inkele metaboliet wurdt in oardere Si-ferdieling ferwachte, wêrby't de metaboliet de Si-wearde sil ferheegje neffens syn ferdigeningswearde (figuer 1B). Yn dizze rjochting ferklearje wy de MT-teory om te foarsizzen dat eksitaasje sil liede ta (i) net-rjochtingferoarings yn metaboliten dy't resultearje yn in ôfname fan 'e δj-yndeks, en (ii) in tanimming fan 'e Hj-yndeks fanwegen in tanimming fan metabolike ûnwissichheid. Of willekeurichheid, dy't kwantifisearre wurde kin troch Shannon-entropie yn 'e foarm fan generalisearre ferskaat. Wat de metabolike gearstalling oanbelanget, sil de MT-teory de willekeurige ferdieling fan Si foarsizze. Rekken hâldend mei it feit dat bepaalde metaboliten ûnder spesifike omstannichheden ûnder spesifike omstannichheden binne, en oare omstannichheden net ûnder spesifike omstannichheden binne, en har ferdigeningswearde ôfhinklik is fan 'e omjouwing, hawwe wy ek in mingd ferdigeningsmodel foarsteld, wêryn δj en Hj yn twa ferdield binne lâns Si. Tanimming yn alle rjochtingen, allinich bepaalde metabolietgroepen, dy't hegere ferdigeningswearden hawwe, sille Si benammen ferheegje, wylst oaren in willekeurige ferdieling hawwe (Ofbylding 1B).
Om de opnij definieare ferdigeningsteoryfoarsizzing op 'e as fan' e ynformaasjeteorydeskriptor te testen, hawwe wy ekspert (Ms) of generalist (Sl) herbivoarlarven op 'e blêden fan Nepenthes pallens ophelle (figuer 2A). Mei help fan MS/MS-analyze hawwe wy 599 net-redundante MS/MS-spektra (gegevensbestân S1) ophelle út metanolekstrakten fan blêdweefsel sammele nei it fieden fan rûpen. Mei help fan RDPI-, Hj- en δj-yndeksen om de rekonfiguraasje fan ynformaasjeynhâld yn MS/MS-konfiguraasjebestannen te visualisearjen, ûntbleatet it nijsgjirrige patroanen (figuer 2B). De algemiene trend is dat, lykas beskreaun troch de ynformaasjedeskriptor, as de rûpen trochgean mei it iten fan blêden, de mjitte fan alle metabolike reorganisaasje yn 'e rin fan' e tiid tanimt: 72 oeren nei't de herbivoar yt, nimt de RDPI signifikant ta. Yn ferliking mei de net-beskeadige kontrôle wie Hj signifikant fermindere, wat te tankjen wie oan 'e ferhege mjitte fan spesjalisaasje fan it metabolike profyl, dat kwantifisearre waard troch de δj-yndeks. Dizze skynbere trend is yn oerienstimming mei de foarsizzingen fan 'e OD-teory, mar is net yn oerienstimming mei de wichtichste foarsizzingen fan 'e MT-teory, dy't leaut dat willekeurige (net-rjochting) feroarings yn metabolietnivo's brûkt wurde as in ferdigenjende kamouflage (Figuer 1B). Hoewol de ynhâld fan 'e orale sekresje (OS) elicitor en it fiedingsgedrach fan dizze twa herbivoren oars binne, resultearre har direkte fieding yn ferlykbere feroarings yn 'e rjochtingen fan Hj en δj tidens de 24-oere en 72-oere rispingeperioaden. It ienige ferskil kaam foar nei 72 oeren RDPI. Yn ferliking mei dat feroarsake troch Ms-fieding, wie it algemiene metabolisme dat feroarsake waard troch Sl-fieding heger.
(A) Eksperiminteel ûntwerp: gewoane bargen (S1) of saakkundige (Ms) herbivoaren wurde fiede mei ûntsâlte blêden fan bekerplanten, wylst foar simulearre herbivoary de OS fan Ms (W + OSM's) brûkt wurdt om de punktuer fan standerdisearre blêdposysjeswûne te behanneljen. S1 (W + OSSl) larven of wetter (W + W). De kontrôle (C) is in ûnbeskeadige blêd. (B) Indusearberens (RDPI yn ferliking mei de kontrôlekaart), ferskaat (Hj-yndeks) en spesjalisaasje (δj-yndeks) yndeks berekkene foar de spesjale metabolietkaart (599 MS/MS; gegevensbestân S1). Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan tusken de direkte herbivoarfieding en de kontrôlegroep (Studint's t-test mei paired t-test, *P<0.05 en ***P<0.001). ns, net wichtich. (C) Tiidsresolúsje-yndeks fan haadspektrum (blauwe doaze, aminosoer, organysk soer en sûker; gegevensbestân S2) en spesjaal metabolietspektrum (reade doaze 443 MS/MS; gegevensbestân S1) nei simulearre herbivoaryske behanneling. De kleureband ferwiist nei it 95% fertrouwensynterval. It stjerke jout it signifikante ferskil oan tusken de behanneling en de kontrôle [kwadratyske fariânsjeanalyse (ANOVA), folge troch Tukey's earlik signifikante ferskil (HSD) foar post hoc meardere fergelikingen, *P<0.05, **P<0.01 en *** P <0.001]. (D) Spesjalisaasje fan ferspriedingsdiagrammen en spesjale metabolietprofilen (werhelle samples mei ferskillende behannelingen).
Om te ûndersiikjen oft de troch herbivoaren feroarsake remodelling op it metaboloomnivo wjerspegele wurdt yn 'e feroaringen yn it nivo fan yndividuele metaboliten, hawwe wy ús earst rjochte op 'e metaboliten dy't earder bestudearre binne yn 'e blêden fan Nepenthes pallens mei bewiisde herbivoarresistinsje. Fenolyske amiden binne hydroxycinnamamide-polyamine-konjugaten dy't opbouwe tidens it herbivoarproses fan ynsekten en bekend binne om de prestaasjes fan ynsekten te ferminderjen (32). Wy hawwe de foarrinners fan 'e oerienkommende MS/MS trochsocht en har kumulative kinetische krommen plotte (figuer S1). Net ferrassend wurde fenolderivaten dy't net direkt belutsen binne by de ferdigening tsjin herbivoaren, lykas chlorogeensoer (CGA) en rutine, nei herbivoarisme nei ûnderen regele. Yn tsjinstelling kinne herbivoaren fenolamiden tige potent meitsje. De trochgeande fieding fan 'e twa herbivoaren resultearre yn hast itselde eksitaasjespektrum fan fenolamiden, en dit patroan wie foaral dúdlik foar de novo synteze fan fenolamiden. Itselde ferskynsel sil waarnommen wurde by it ûndersykjen fan 'e 17-hydroxygeranyl nonaandiol diterpeen glykosiden (17-HGL-DTGs) paadwize, dy't in grut oantal asyklyske diterpenen produseart mei effektive anty-herbivoarfunksjes (33), wêrfan Ms Feeding with Sl in ferlykber ekspresjeprofyl triggerde (figuer S1)).
It mooglike neidiel fan direkte fiedingseksperiminten mei herbivoaren is it ferskil yn blêdkonsumpsjesnelheid en fiedingstiid fan herbivoaren, wat it lestich makket om de herbivoar-spesifike effekten feroarsake troch wûnen en herbivoaren te eliminearjen. Om de spesifisiteit fan 'e herbivoar-soarte fan' e ynducearre blêdmetabolismereaksje better op te lossen, hawwe wy it fieden fan Ms- en Sl-larven simulearre troch de farske sammele OS (OSM en OSS1) direkt ta te passen op 'e standertpunksje W fan konsekwinte blêdposysjes. Dizze proseduere wurdt W + OS-behanneling neamd, en it standardisearret de ynduksje troch it presys te timen fan it begjin fan 'e reaksje dy't troch de herbivoar oproppen wurdt sûnder betiizjende effekten fan ferskillen yn 'e snelheid of kwantiteit fan weefselferlies te feroarsaakjen (figuer 2A) (34). Mei help fan 'e MS/MS-analyze- en berekkeningspipeline hawwe wy 443 MS/MS-spektra (gegevensbestân S1) ophelle, dy't oerlappen mei de spektra dy't earder gearstald wiene út direkte fiedingseksperiminten. De ynformaasjeteory-analyze fan dizze MS/MS-dataset liet sjen dat it opnij programmearjen fan blêd-spesjalisearre metabolomen troch it simulearjen fan herbivoaren OS-spesifike ynduksjes liet sjen (figuer 2C). Benammen, yn ferliking mei OSS1-behanneling, feroarsake OSM in ferbettering fan metaboloomspesjalisaasje nei 4 oeren. It is it neamen wurdich dat, yn ferliking mei de direkte herbivoarfieding eksperimintele dataset, de metabolike kinetika visualisearre yn twadiminsjonale romte mei Hj en δj as koördinaten en de rjochting fan 'e metaboloomspesjalisaasje yn reaksje op simulearre herbivoarbehanneling oer tiid konsekwint tanimme (figuer 2D). Tagelyk kwantifisearren wy de ynhâld fan aminosoeren, organyske soeren en sûkers (databestân S2) om te ûndersykjen oft dizze rjochte ferheging fan metaboloomekspertize te tankjen is oan 'e opnij konfiguraasje fan sintraal koalstofmetabolisme yn reaksje op simulearre herbivoaren (figuer S2). Om dit patroan better te ferklearjen, hawwe wy fierder de metabolike akkumulaasjekinetika fan 'e earder besprutsen fenolamide- en 17-HGL-DTG-paden kontrolearre. De OS-spesifike ynduksje fan herbivoaren wurdt omfoarme ta in differinsjaal omrangskikkingspatroan binnen it fenolamidemetabolisme (Ofbylding S3). Fenolyske amiden dy't coumarine- en caffeoyl-molekulen befetsje, wurde by foarkar ynducearre troch OSS1, wylst OSM's in spesifike ynduksje fan ferulylkonjugaten triggerje. Foar it 17-HGL-DTG-paad waard differinsjaal OS-ynduksje troch downstream malonylaasje- en dimalonylaasjeprodukten ûntdutsen (Ofbylding S3).
Folgjende hawwe wy de OS-induzearre transkriptoomplastisiteit bestudearre mei de tiidsferrin microarray-dataset, dy't it gebrûk fan OSM's simulearret om de blêden fan 'e rozetplantblêden yn herbivoaren te behanneljen. De samplingkinetyk oerlaapje yn prinsipe mei de kinetyk dy't brûkt wurdt yn dizze metabolomics-stúdzje (35). Yn ferliking mei de metaboloomrekonfiguraasje wêryn metabolike plastisiteit benammen yn 'e rin fan' e tiid ferhege wurdt, observearje wy tydlike transkripsje-bursts yn blêden feroarsake troch Ms, wêrby't transkriptoom-inducabiliteit (RDPI) en spesjalisaasje (δj) op 1 binne. Der wie in wichtige tanimming fan oeren, en ferskaat (Hj) op dit tiidpunt, de ekspresje fan BMP1 wie signifikant fermindere, folge troch de ûntspanning fan transkriptoomspesjalisaasje (figuer S4). Metabolyske genfamyljes (lykas P450, glycosyltransferase, en BAHD-acyltransferase) nimme diel oan it proses fan it gearstallen fan spesjale metaboliten út strukturele ienheden ôflaat fan primêr metabolisme, neffens it neamde iere hege-spesjalisaasjemodel. As in gefalstúdzje waard de fenylalanine-paad analysearre. De analyze befêstige dat de kearngenen yn fenolamidemetabolisme sterk OS-induzearre binne yn herbivoaren yn ferliking mei net-oanlutsen planten, en nau oerienkomme yn har ekspresjepatroanen. De transkripsjefaktor MYB8 en strukturele genen PAL1, PAL2, C4H en 4CL yn 'e stroomopwaartse fan dizze paad lieten in iere inisjaasje fan transkripsje sjen. Acyltransferasen dy't in rol spylje yn 'e definitive gearstalling fan fenolamide, lykas AT1, DH29 en CV86, litte in langdurich opregulearringspatroan sjen (figuer S4). De boppesteande observaasjes jouwe oan dat de iere inisjaasje fan transkriptoomspesjalisaasje en de lettere ferbettering fan metabolomikaspesjalisaasje in keppele modus binne, dy't mooglik te tankjen is oan it syngroane regeljouwingssysteem dat in krêftige ferdigeningsreaksje inisjearret.
De rekonfiguraasje yn planthormonesignalisaasje fungearret as in regeljouwingslaach dy't herbivoarynformaasje yntegreart om de fysiology fan planten opnij te programmearjen. Nei de herbivoarsimulaasje hawwe wy de kumulative dynamyk fan wichtige planthormonekategoryen metten en de tydlike ko-ekspresje tusken har visualisearre [Pearson-korrelaasjekoëffisjint (PCC) > 0.4] (figuer 3A). Lykas ferwachte binne planthormonen dy't relatearre binne oan biosynteze keppele binnen it planthormone-ko-ekspresjenetwurk. Derneist wurdt metabolike spesifisiteit (Si-yndeks) yn kaart brocht nei dit netwurk om de planthormonen te markearjen dy't troch ferskate behannelingen feroarsake wurde. Twa haadgebieten fan herbivoarspesifike respons wurde tekene: ien is yn it JA-kluster, wêr't JA (syn biologysk aktive foarm JA-Ile) en oare JA-derivaten de heechste Si-skoare sjen litte; de ​​oare is etyleen (ET). Gibberelline liet allinich in matige tanimming fan herbivoarspesifisiteit sjen, wylst oare planthormonen, lykas cytokinine, auxine en abscisinezuur, in lege ynduksjespesifisiteit hiene foar herbivoaren. Yn ferliking mei it brûken fan allinnich W + W, kin de fersterking fan 'e pykwearde fan JA-derivaten fia de OS-applikaasje (W + OS) yn prinsipe omfoarme wurde ta in sterke spesifike yndikator fan JA's. Unferwachts is bekend dat OSM en OSS1 mei ferskillende elicitorynhâld in ferlykbere opgarjen fan JA en JA-Ile feroarsaakje. Yn tsjinstelling ta OSS1 wurdt OSM spesifyk en sterk ynducearre troch OSM's, wylst OSS1 de reaksje fan basale wûnen net fersterket (Ofbylding 3B).
(A) Ko-ekspresje netwurkanalyse basearre op PCC-berekkening fan herbivoar-induzearre planthormoan opgarjen kinetika simulaasje. It knooppunt fertsjintwurdiget ien planthormoan, en de grutte fan it knooppunt fertsjintwurdiget de Si-yndeks spesifyk foar it planthormoan tusken behannelingen. (B) Opgarjen fan JA, JA-Ile en ET yn blêden feroarsake troch ferskate behannelingen oanjûn troch ferskate kleuren: abrikoos, W + OSM; blau, W + OSSl; swart, W + W; griis, C (kontrôle). Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan tusken behanneling en kontrôle (twa-wei ANOVA folge troch Tukey HSD post hoc meardere ferliking, *** P <0.001). Ynformaasjeteoryanalyse fan (C) 697 MS/MS (gegevensbestân S1) yn JA-biosynteze en beheind waarnimmingsspektrum (irAOC en irCOI1) en (D) 585 MS/MS (gegevensbestân S1) yn ETR1 mei beheind ET-sinjaal Twa simulearre herbivoarbehannelingen aktivearren plantlinen en lege draachmiddel (EV) kontrôleplanten. Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan tusken W+OS-behanneling en ûnskeadige kontrôle (twa-wei ANOVA folge troch Tukey HSD post hoc meardere ferliking, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). (E) Fersprate grafyken fan fersprate opposysje tsjin spesjalisaasje. De kleuren fertsjintwurdigje ferskate genetysk modifisearre stammen; de symboalen fertsjintwurdigje ferskate behannelingmetoaden: trijehoek, W + OSS1; rjochthoek, W + OSM; sirkel C
Folgjende brûke wy in genetysk modifisearre stam fan ferswakke Nepenthes (irCOI1 en sETR1) yn 'e kaaistappen fan JA- en ET-biosynteze (irAOC en irACO) en persepsje (irCOI1 en sETR1) om it metabolisme fan dizze twa planthormonen op herbivoaren te analysearjen. De relative bydrage fan reprogrammearring. Yn oerienstimming mei eardere eksperiminten hawwe wy de ynduksje fan herbivoar-OS yn lege drager (EV) planten befêstige (figuer 3, C oant D) en de algemiene ôfname yn 'e Hj-yndeks feroarsake troch OSM, wylst de δj-yndeks tanommen is. De reaksje is mear útsprutsen as de reaksje triggerd troch OSS1. In twa-line grafyk mei Hj en δj as koördinaten lit de spesifike deregulaasje sjen (figuer 3E). De meast foar de hân lizzende trend is dat yn stammen sûnder JA-sinjaal, de metaboloomferskaat en spesjalisaasjeferoarings feroarsake troch herbivoaren hast folslein eliminearre binne (figuer 3C). Yn tsjinstelling, de stille ET-waarnimming yn sETR1-planten, hoewol it algemiene effekt op feroaringen yn herbivoar metabolisme folle leger is as dat fan JA-sinjalearring, ferswakket it ferskil yn Hj- en δj-yndeksen tusken OSM- en OSS1-eksitaasjes (Figuer 3D en Figuer S5). Dit jout oan dat neist de kearnfunksje fan JA-sinjaaltransduksje, ET-sinjaaltransduksje ek tsjinnet as in fynôfstimming fan 'e soartespesifike metabolike reaksje fan herbivoaren. Yn oerienstimming mei dizze fynôfstimmingsfunksje wie der gjin feroaring yn 'e algemiene metaboloom-ynducearberens yn sETR1-planten. Oan 'e oare kant, yn ferliking mei sETR1-planten, indusearren irACO-planten ferlykbere algemiene amplitudes fan metabolike feroaringen feroarsake troch herbivoaren, mar lieten signifikant ferskillende Hj- en δj-skoares sjen tusken OSM- en OSS1-útdagings (Figuer S5).
Om spesjalisearre metaboliten te identifisearjen dy't wichtige bydragen leverje oan 'e soartespesifike reaksje fan herbivoaren en har produksje te fynôfstimmen fia ET-sinjalen, hawwe wy de earder ûntwikkele strukturele MS/MS-metoade brûkt. Dizze metoade fertrout op 'e bi-klusteringsmetoade om de metabolike famylje opnij ôf te lieden út MS/MS-fragminen [normalisearre puntprodukt (NDP)] en oerienkomstskoare basearre op neutraal ferlies (NL). De MS/MS-dataset dy't gearstald is troch de analyze fan ET-transgene linen produsearre 585 MS/MS (databestân S1), dy't oplost binne troch se te klusterjen yn sân haad MS/MS-modules (M) (figuer 4A). Guon fan dizze modules binne ticht ynpakt mei earder karakterisearre spesjale metaboliten: bygelyks, M1, M2, M3, M4 en M7 binne ryk oan ferskate fenolderivaten (M1), flavonoïde glykosiden (M2), acylsûkers (M3 en M4), en 17-HGL-DTG (M7). Derneist wurdt de metabolike spesifike ynformaasje (Si-yndeks) fan in inkele metaboliet yn elke module berekkene, en syn Si-ferdieling kin yntuïtyf sjoen wurde. Koartsein, MS/MS-spektra dy't hege herbivoaryske en genotypespesifisiteit sjen litte, wurde karakterisearre troch hege Si-wearden, en kurtose-statistiken jouwe de ferdieling fan pels op 'e rjochter sturthoeke oan. Ien sokke meager kolloïdferdieling waard ûntdutsen yn M1, wêryn fenolamide de heechste Si-fraksje sjen liet (figuer 4B). De earder neamde herbivoaryske ynducearbere 17-HGL-DTG yn M7 liet in matige Si-skoare sjen, wat in matige mjitte fan ferskillende regeljouwing tusken de twa OS-typen oanjout. Yn tsjinstelling dêrmei binne de measte konstitutyf produsearre spesjalisearre metaboliten, lykas rutine, CGA en acylsûkers, ûnder de leechste Si-skoares. Om de strukturele kompleksiteit en Si-ferdieling tusken spesjale metaboliten better te ûndersiikjen, waard in molekulêr netwurk foar elke module konstruearre (figuer 4B). In wichtige foarsizzing fan 'e OD-teory (gearfette yn figuer 1B) is dat de reorganisaasje fan spesjale metaboliten nei herbivoarium moat liede ta ienrjochtingsferoaringen yn metaboliten mei hege ferdigeningswearde, foaral troch it fergrutsjen fan har spesifisiteit (yn tsjinstelling ta willekeurige ferdieling) Modus) Defensive metaboliet foarsein troch MT-teory. De measte fan 'e fenolderivaten dy't opboud binne yn M1 binne funksjoneel relatearre oan 'e delgong fan ynsektenprestaasjes (32). By it fergelykjen fan 'e Si-wearden yn' e M1-metaboliten tusken de ynducearre blêden en de gearstallende blêden fan 'e EV-kontrôleplanten nei 24 oeren, hawwe wy waarnommen dat de metabolike spesifisiteit fan in protte metaboliten nei herbivoariumynsekten in wichtige tanimmende trend hat (figuer 4C). De spesifike tanimming fan Si-wearde waard allinich waarnommen yn ferdigeningsfenolamiden, mar gjin tanimming fan Si-wearde waard waarnommen yn oare fenolen en ûnbekende metaboliten dy't yn dizze module tegearre besteane. Dit is in spesjalisearre model, dat relatearre is oan 'e OD-teory. De wichtichste foarsizzingen fan metabolike feroaringen feroarsake troch herbivoaren binne konsekwint. Om te testen oft dizze bysûnderheid fan it fenolamidespektrum feroarsake waard troch OS-spesifike ET, hawwe wy de metaboliet Si-yndeks plotte en in ferskillende ekspresjewearde feroarsake tusken OSM en OSS1 yn 'e EV- en sETR1-genotypen (figuer 4D). Yn sETR1 waard it fenamide-induzearre ferskil tusken OSM en OSS1 sterk fermindere. De bi-klusteringsmetoade waard ek tapast op MS/MS-gegevens sammele yn stammen mei ûnfoldwaande JA om de wichtichste MS/MS-modules relatearre oan JA-regulearre metabolike spesjalisaasje ôf te lieden (figuer S6).
(A) De klusterresultaten fan 585 MS/MS basearre op dielde fragmint (NDP-oerienkomst) en dielde neutrale ferlies (NL-oerienkomst) resultearje yn 'e module (M) dy't konsekwint is mei de bekende ferbiningsfamylje, of troch ûnbekende of min metabolisearre metabolite-gearstalling. Njonken elke module wurdt de spesifike (Si) ferdieling fan 'e metaboliet (MS/MS) werjûn. (B) Modulêr molekulêr netwurk: Knooppunten fertsjintwurdigje MS/MS en rânen, NDP (read) en NL (blau) MS/MS-skoares (ôfsnijpunt, > 0.6). De gradearre metaboliet-spesifisiteitsyndeks (Si) kleurd op basis fan 'e module (lofts) en yn kaart brocht oan it molekulêre netwurk (rjochts). (C) Module M1 fan EV-plant yn konstitutive (kontrôle) en ynducearre steat (simulearre herbivoar) nei 24 oeren: molekulêr netwurkdiagram (Si-wearde is de knooppuntgrutte, defensyf fenolamide is markearre yn blau). (D) It M1 molekulêre netwurkdiagram fan 'e spektrumline sETR1 mei beheinde EV- en ET-persepsje: de fenolyske ferbining fertsjintwurdige troch de griene sirkelknoop, en it signifikante ferskil (P-wearde) tusken W + OSM- en W + OSS1-behannelingen as knooppuntgrutte. CP, N-kaffeoyl-tyrosine; CS, N-kaffeoyl-spermidine; FP, N-ferulinezuurester-urinezuur; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-kaffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum yn wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acylsûker.
Wy hawwe de analyze fierder útwreide fan in inkele ferswakke Nepenthes-genotype nei natuerlike populaasjes, wêr't sterke intraspesifike feroarings yn herbivoare JA-nivo's en spesifike metabolietnivo's earder beskreaun binne yn natuerlike populaasjes (26). Brûk dizze dataset om 43 kiemplasma's te dekken. Dizze kiemplasma's besteane út 123 soarten planten fan N. pallens. Dizze planten waarden nommen fan sied sammele yn ferskate lânseigen habitats yn Utah, Nevada, Arizona en Kalifornje (figuer S7), wy hawwe de metaboloomferskaat (hjir neamd populaasjenivo) β-ferskaat) en de spesjalisaasje feroarsake troch OSM berekkene. Yn oerienstimming mei eardere stúdzjes hawwe wy in breed skala oan metabolike feroarings waarnommen lâns de Hj- en δj-assen, wat oanjout dat kiemplasma's wichtige ferskillen hawwe yn 'e plastisiteit fan har metabolike reaksjes op herbivoaren (figuer S7). Dizze organisaasje docht tinken oan eardere observaasjes oer it dynamyske berik fan JA-feroarings feroarsake troch herbivoaren, en hat in heul hege wearde behâlden yn in inkele populaasje (26, 36). Troch JA en JA-Ile te brûken om de algemiene nivo-korrelaasje tusken Hj en δj te testen, hawwe wy fûn dat der in wichtige positive korrelaasje is tusken JA en de metaboloom β-ferskaat- en spesjalisaasje-yndeks (figuer S7). Dit suggerearret dat de herbivoar-induzearre heterogeniteit yn JA-ynduksje dy't op populaasjenivo ûntdutsen is, mooglik te tankjen is oan wichtige metabolike polymorfismen feroarsake troch seleksje út ynsektenherbivoaren.
Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat tabaksoarten sterk ferskille yn type en relative ôfhinklikens fan ynducearre en konstitutive metabolike ferdigeningswurken. Der wurdt fan útgien dat dizze feroarings yn anty-herbivoar sinjaaltransduksje en ferdigeningsmooglikheden wurde regele troch ynsektenpopulaasjedruk, plantlibbensyklus en ferdigeningsproduksjekosten yn 'e nis wêr't in bepaalde soarte groeit. Wy hawwe de konsistinsje fan blêdmetaboloomferbouwing bestudearre dy't feroarsake wurdt troch herbivoaren fan seis Nicotiana-soarten dy't lânseigen binne yn Noard-Amearika en Súd-Amearika. Dizze soarten binne nau besibbe oan Nepenthes Noard-Amearika, nammentlik Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. ferswakke gers, Nicotiana tabacum, lineêre tabak, tabak (Nicotiana spegazzinii) en tabaksblêdtabak (Nicotiana obtusifolia) (Ofbylding 5A) (37). Seis fan dizze soarten, ynklusyf de goed karakterisearre soarte N. please, binne ienjierrige planten fan 'e petunia-klade, en obtusifolia N. binne perennialen fan 'e susterklade Trigonophyllae (38). Dêrnei waarden W + W, W + OSM en W + OSS1-ynduksje útfierd op dizze sân soarten om de metabolike herrangskikking fan ynsektenfieding op soartenivo te bestudearjen.
(A) In bootstrap fylogenetyske beam basearre op maksimale kâns [foar nukleêre glutaminesynteze (38)] en de geografyske fersprieding fan sân nau besibbe Nicotiana-soarten (ferskillende kleuren) (37). (B) In ferspriedingsdiagram fan spesjalisearre ferskaat foar de metabolike profilen fan sân Nicotiana-soarten (939 MS/MS; gegevensbestân S1). Op soartenivo is metaboloomferskaat negatyf korrelearre mei de mjitte fan spesjalisaasje. De analyze fan 'e korrelaasje op soartenivo tusken metabolike ferskaat en spesjalisaasje en JA-akkumulaasje wurdt werjûn yn figuer 2. S9. Kleur, ferskate typen; trijehoek, W + OSS1; rjochthoek, W + OSM; (C) Nicotiana JA- en JA-Ile-dynamyk wurde rangearre neffens OS-eksitaasjeamplitude (twa-wei ANOVA en Tukey HSD nei meardere ferliking, * P <0.05, ** P <0.01 en * ** Foar ferliking fan W + OS en W + W, P <0.001). Boxplot fan (D) ferskaat en (E) spesjalisaasje fan elke soarte nei it simulearjen fan herbivoar en methyl JA (MeJA). De asterisk jout it signifikante ferskil oan tusken W + OS en W + W of lanoline plus W (Lan + W) of Lan plus MeJA (Lan + MeJa) en Lan-kontrôle (twawege fariânsje-analyze, folge troch Tukey's HSD post hoc meardere ferliking, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001).
Mei help fan 'e dûbele klustermetoade hawwe wy 9 modules fan 939 MS/MS identifisearre (databestân S1). De gearstalling fan MS/MS dy't opnij konfigurearre binne troch ferskate behannelingen ferskilt sterk tusken ferskate modules tusken soarten (figuer S8). It fisualisearjen fan Hj (hjir oantsjutten as soarte-nivo γ-ferskaat) en δj lit sjen dat ferskate soarten aggregearje yn heul ferskillende groepen yn 'e metabolike romte, wêr't ferdieling op soarte-nivo meastentiids promininter is as eksitaasje. Mei útsûndering fan N. linear en N. obliquus litte se in breed dynamysk berik fan ynduksje-effekten sjen (figuer 5B). Yn tsjinstelling hawwe soarten lykas N. purpurea en N. obtusifolia in minder dúdlike metabolike reaksje op behanneling, mar it metaboloom is ferskaater. De soartespesifike ferdieling fan 'e ynducearre metabolike reaksje resultearre yn in wichtige negative korrelaasje tusken spesjalisaasje en gamma-ferskaat (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). OS-induzearre feroarings yn JA-nivo's binne posityf korrelearre mei metaboloomspesjalisaasje, en negatyf korrelearre mei de metabolike gamma-ferskaat dy't troch elke soarte werjûn wurdt (figuer 5B en figuer S9). It is it neamen wurdich dat de soarten dy't yn 'e folksmûle oantsjutten wurde as "sinjaalreaksje"-soarten yn figuer 5C, lykas Nepenthes nematoden, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, en Nepenthes attenuated, wichtige tekens feroarsaken nei 30 minuten. De resinte OS-spesifike JA- en JA-Ile-útbraken, wylst oare baktearjes dy't "sinjaal-ûnresponsyf" neamd wurde, lykas Nepenthes mills, Nepenthes powdery en N. obtusifolia allinich JA-Ile Edge-ynduksje sjen litte sûnder OS-spesifisiteit (figuer 5C). Op it metabolike nivo, lykas hjirboppe neamd, lieten de sinjaal-responsive stoffen foar ferswakke Nepenthes OS-spesifisiteit sjen en ferhegen δj signifikant, wylst se Hj fermindere. Dit OS-spesifike priming-effekt waard net ûntdutsen yn soarten dy't klassifisearre binne as sinjaal-net-reaktive soarten (Ofbylding 5, D en E). OS-spesifike metaboliten wurde faker dield tusken sinjaal-responsive soarten, en dizze sinjaalklusters klusterje mei soarten mei swakkere sinjaalreaksjes, wylst soarten mei swakkere sinjaalreaksjes minder ûnderlinge ôfhinklikens sjen litte (Ofbylding S8). Dit resultaat jout oan dat de OS-spesifike ynduksje fan JA's en de OS-spesifike rekonfiguraasje fan it downstream-metaboloom keppele binne op soartenivo.
Folgjende hawwe wy in lanolinpasta brûkt mei methyl JA (MeJA) om planten te behanneljen om te ûndersykjen oft dizze koppelingsmodi beheind wurde troch de beskikberens fan JA tapast troch eksogene JA, dy't yn it cytoplasma fan planten sil wêze. Fluch deesterifikaasje is JA. Wy fûnen deselde trend fan 'e stadige feroaring fan sinjaal-responsive soarten nei sinjaal-net-responsive soarten feroarsake troch de trochgeande oanfier fan JA (Ofbylding 5, D en E). Koartsein, MeJA-behanneling herprogrammearre de metabolomen fan lineêre nematoden, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, en N. mikimotoi sterk, wat resultearre yn in wichtige tanimming fan δj en in ôfname yn Hj. N. purpurea liet allinich in tanimming sjen yn δj, mar net Hj. N. obtusifolia, dy't earder oantoand is dat it ekstreem lege nivo's fan JA's akkumulearret, reagearret ek min op MeJA-behanneling yn termen fan metaboloomrekonfiguraasje. Dizze resultaten jouwe oan dat JA-produksje of sinjaaltransduksje fysiologysk beheind is yn sinjaal-net-responsive soarten. Om dizze hypoteze te testen, hawwe wy de fjouwer soarten (N. pallens, N. mills, N. pink en N. microphylla) bestudearre dy't feroarsake waarden troch W + W, W + OSM's en W + OSS1 Transkriptoom (39). Yn oerienstimming mei it patroan fan metaboloomremodellering binne de soarten goed skieden yn 'e transkriptoomromte, wêrfan N. attenuated de heechste OS-induzearre RDPI liet sjen, wylst N. gracilis de leechste hie (figuer 6A). It waard lykwols fûn dat de transkriptoomferskaat feroarsake troch N. oblonga it leechst wie ûnder de fjouwer soarten, yn tsjinstelling ta de heechste metabonomyske ferskaat fan N. oblonga dy't earder yn sân soarten oantoand waard. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat in set genen relatearre oan iere ferdigeningssignalen, ynklusyf JA-signalen, de spesifisiteit ferklearret fan iere ferdigeningsreaksjes feroarsake troch herbivoar-relatearre elicitors yn Nicotiana-soarten (39). Fergeliking fan 'e JA-sinjaalpaden tusken dizze fjouwer soarten liet in nijsgjirrich patroan sjen (figuer 6B). De measte genen yn dizze paadwize, lykas AOC, OPR3, ACX en COI1, lieten relatyf hege nivo's fan ynduksje sjen yn dizze fjouwer soarten. In kaaigen, JAR4, konvertearret lykwols JA yn syn biologysk aktive foarm fan JA-Ile-akkumulearre transkripten, en syn transkripsjenivo is tige leech, foaral yn N. mills, Nepenthes pieris en N. microphylla. Derneist waard allinich it transkript fan in oar gen AOS net ûntdutsen yn N. bifidum. Dizze feroarings yn genekspresje kinne ferantwurdlik wêze foar de ekstreme fenotypen feroarsake troch de lege JA-produksje yn sinjaal-anergyske soarten en de ynduksje fan N. gracilis.
(A) Ynformaasjeteory-analyze fan 'e reprogrammearring fan iere transkripsjonele reaksjes fan fjouwer nau besibbe tabakssoarten dy't 30 minuten nei herbivoarynduksje sampled binne. RDPI wurdt berekkene troch de blêden dy't feroarsake binne troch de herbivoar OS te fergelykjen mei de wûnekontrôle. De kleuren jouwe ferskate soarten oan, en de symboalen jouwe ferskate behannelingmetoaden oan. (B) Analyse fan genekspresje yn JA-sinjaalpaden ûnder fjouwer soarten. It ferienfâldige JA-paad wurdt werjûn neist de boxplot. Ferskillende kleuren jouwe ferskate ferwurkingsmetoaden oan. De asterisk jout oan dat der in signifikant ferskil is tusken de W + OS-behanneling en de W + W-kontrôle (foar de Student's t-test foar peargewijze ferskillen, *P<0.05, **P<0.01 en ***P<0.001). OPDA, 12-oxofytodienoïsoer; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentaan-1-oktaansoer.
Yn it lêste diel hawwe wy bestudearre hoe't ynsekten-soarte-spesifike remodelling fan it metaboloom fan ferskate plantesoarten resistint wêze kin tsjin herbivoaren. Earder ûndersyk hat de klam lein op it Nicotiana-geslacht. Harren resistinsje tsjin Ms en larven ferskilt sterk (40). Hjir hawwe wy de ferbining tusken dit model en harren metabolike plastisiteit bestudearre. Mei help fan de boppesteande fjouwer tabaksoarten, en it testen fan de korrelaasje tusken de ferskaat en spesjalisaasje fan it metaboloom feroarsake troch herbivoaren en de resistinsje fan planten tsjin Ms en Sl, hawwe wy fûn dat de resistinsje, ferskaat en spesjalisaasje tsjin de generalist Sl All posityf korrelearre binne, wylst de korrelaasje tusken resistinsje tsjin saakkundige dames en spesjalisaasje swak is, en de korrelaasje mei ferskaat net signifikant is (figuer S10). Wat S1-resistinsje oanbelanget, hienen sawol de ferswakke N. chinensis as N. gracilis, dy't earder sawol JA-sinjaaltransduksjenivo's as metaboloomplastisiteit sjen lieten, tige ferskillende reaksjes op herbivoarinduksje, en se lieten ek ferlykbere hege resistinsje sjen. Seks.
Yn 'e ôfrûne sechtich jier hat de teory fan plantferdigening in teoretysk ramt levere, basearre op hokker ûndersikers in flink oantal evolúsjes en funksjes fan spesjalisearre metaboliten yn planten foarsein hawwe. De measte fan dizze teoryen folgje net de normale proseduere fan sterke ynferinsjes (41). Se stelle wichtige foarsizzingen (3) foar op itselde nivo fan analyze. As it testen fan wichtige foarsizzingen it mooglik makket om spesifike teoryen te analysearjen, sil dit de It fjild giet foarút. Wurde stipe, mar fersmite oaren (42). Ynstee dêrfan makket de nije teory foarsizzingen op ferskate nivo's fan analyze en foeget in nije laach fan beskriuwende oerwagings ta (42). De twa teoryen dy't op funksjoneel nivo foarsteld binne, MT en OD, kinne lykwols maklik útlein wurde as wichtige foarsizzingen fan spesjalisearre metabolike feroarings feroarsake troch herbivoaren: OD-teory is fan betinken dat feroarings yn spesjalisearre metabolike "romte" tige rjochtingsrjochting hawwe. De MT-teory is fan betinken dat dizze feroarings net-rjochtingsrjochting sille wêze en willekeurich yn 'e metabolike romte lizze, en de neiging hawwe om metaboliten mei hege ferdigeningswearde te hawwen. Eardere ûndersiken fan OD- en MT-foarsizzingen binne hifke mei in smelle set fan a priori "ferdigenings"-ferbiningen. Dizze metaboliet-sintraal testen foarkomme de mooglikheid om de omfang en it trajekt fan metaboloom-rekonfiguraasje tidens herbivoar te analysearjen, en tastean testen binnen in konsekwint statistysk ramt net ta om wichtige foarsizzingen te fereaskjen dy't as in gehiel beskôge wurde kinne Kwantifisearje feroarings yn plantmetaboloom. Hjir hawwe wy de ynnovative technology yn metabolomika brûkt basearre op komputasjonele MS en dekonvolúsje MS-analyze útfierd yn 'e algemiene jildigens fan ynformaasjeteory-deskriptoren om it ûnderskied tusken de twa te testen dy't foarsteld binne op it wrâldwide metabolomika-nivo. De wichtichste foarsizzing fan dizze teory. Ynformaasjeteory is tapast op in protte fjilden, foaral yn 'e kontekst fan biodiversiteit en fiedingsstreamûndersyk (43). Foar safier't wy witte, is dit lykwols de earste tapassing dy't brûkt wurdt om de metabolike ynformaasjeromte fan planten te beskriuwen en ekologyske problemen op te lossen dy't relatearre binne oan tydlike metabolike feroarings yn reaksje op miljeu-oanwizings. Yn it bysûnder leit it fermogen fan dizze metoade yn syn fermogen om patroanen binnen en tusken plantesoarten te fergelykjen om te ûndersiikjen hoe't herbivoaren evoluearre binne fan ferskate soarten nei makro-evolúsjonêre patroanen tusken soarten op ferskate nivo's fan evolúsje. Metabolisme.
Haadkomponintanalyse (PCA) konvertearret in multivariate dataset nei in dimensjonaliteitsreduksjeromte, sadat de haadtrend fan 'e gegevens útlein wurde kin, dus it wurdt meastentiids brûkt as in ferkennende technyk om de dataset te parsen, lykas dekonvolúsjemetaboloom. Dimensjonaliteitsreduksje sil lykwols in diel fan 'e ynformaasje-ynhâld yn' e dataset ferlieze, en PCA kin gjin kwantitative ynformaasje leverje oer skaaimerken dy't benammen relevant binne foar ekologyske teory, lykas: hoe't herbivoaren ferskaat yn spesjalisearre fjilden (bygelyks rykdom, fersprieding) en oerfloed) metaboliten opnij konfigurearje? Hokker metaboliten binne foarsizzers fan 'e ynducearre steat fan in bepaalde herbivoar? Fanút it perspektyf fan spesifisiteit, ferskaat en ynduceerberens wurdt de ynformaasje-ynhâld fan it blêdspesifike metabolietprofyl ûntbûn, en wurdt fûn dat it iten fan herbivoaren in spesifike metabolisme kin aktivearje. Unferwachts hawwe wy waarnommen dat, lykas beskreaun yn 'e ymplementearre ynformaasjeteory-yndikatoaren, de resultearjende metabolike situaasje in grutte oerlap hat nei de oanfallen fan 'e twa herbivoaren (de nachtfiede generalist Sl) en de Solanaceae-ekspert Ms. Hoewol har fiedingsgedrach en konsintraasje signifikant oars binne. Fetsoer-aminosoerkonjugaat (FAC) inisjator yn OS (31). Troch herbivoar OS te brûken om standerdisearre stekwûnen te behanneljen, liet simulearre herbivoarbehanneling ek in ferlykbere trend sjen. Dizze standerdisearre proseduere foar it simulearjen fan 'e reaksje fan planten op herbivoaroanfallen elimineert de betiizjende faktoaren feroarsake troch feroaringen yn it ytgedrach fan herbivoaren, dy't liede ta ferskillende graden fan skea op ferskillende tiden (34). FAC, dat bekend is as de wichtichste oarsaak fan OSM, ferminderet JAS en oare planthormoanreaksjes yn OSS1, wylst OSS1 hûnderten kearen ferminderet (31). OSS1 feroarsake lykwols ferlykbere nivo's fan JA-akkumulaasje yn ferliking mei OSM. Earder is oantoand dat de JA-reaksje yn ferswakke Nepenthes tige gefoelich is foar OSM, wêrby't FAC syn aktiviteit behâlde kin, sels as it 1:1000 mei wetter verdund is (44). Dêrom, yn ferliking mei OSM, hoewol de FAC yn OSS1 tige leech is, is it genôch om genôch JA-útbraak te indusearjen. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat porine-like proteïnen (45) en oligosacchariden (46) brûkt wurde kinne as molekulêre oanwizings om plantferdigeningsreaksjes yn OSS1 te triggerjen. It is lykwols noch ûndúdlik oft dizze elicitors yn OSS1 ferantwurdlik binne foar de opgarjen fan JA dy't yn 'e hjoeddeiske stúdzje waarnommen is.
Hoewol't der mar in pear stúdzjes binne dy't de ferskillende metabolike fingerprints beskriuwe dy't feroarsake wurde troch de tapassing fan ferskate herbivoaren of eksogene JA of SA (salisylsoer) (47), hat nimmen de soarte-spesifike perturbaasje fan herbivoaren yn it plantgersnetwurk en de effekten dêrfan op 'e spesifike persoanlike ynformaasje fersteurd. Dizze analyze befêstige fierder dat de ferbining fan it ynterne hormoannetwurk mei oare planthormonen as JA's de spesifisiteit foarmet fan 'e metabolike reorganisaasje feroarsake troch herbivoaren. Yn it bysûnder hawwe wy ûntdutsen dat ET feroarsake troch OSM signifikant grutter wie as dat feroarsake troch OSS1. Dizze modus is yn oerienstimming mei mear FAC-ynhâld yn OSM, wat in needsaaklike en foldwaande betingst is foar it triggerjen fan in ET-burst (48). Yn 'e kontekst fan' e ynteraksje tusken planten en herbivoaren is de sinjaalfunksje fan ET op plantspesifike metabolietdynamika noch sporadysk en rjochtet him allinich op ien ferbiningsgroep. Derneist hawwe de measte stúdzjes eksogene tapassing fan ET of syn foargongers of ferskate ynhibitoren brûkt om de regeling fan ET te bestudearjen, wêrûnder dizze eksogene gemyske tapassingen in protte net-spesifike side-effekten sille produsearje. Foar safier't wy witte, fertsjintwurdiget dizze stúdzje it earste grutskalige systematyske ûndersyk nei de rol fan ET yn it gebrûk fan ET om beheinde transgene planten te produsearjen en waar te nimmen om de dynamyk fan plantmetaboloom te koördinearjen. Herbivoar-spesifike ET-ynduksje kin úteinlik de metaboloomreaksje modulearje. De wichtichste is de transgene manipulaasje fan ET-biosynteze (ACO) en waarnimming (ETR1) genen dy't de herbivoar-spesifike de novo opgarjen fan fenolamiden iepenbiere. Earder is oantoand dat ET JA-induzearre nikotine-opgarjen kin fine-tune troch putrescine N-methyltransferase te regeljen (49). Fanút in meganysk eachpunt is it lykwols net dúdlik hoe't ET de ynduksje fan fenamide fine-tunet. Neist de sinjaaltransduksjefunksje fan ET, kin de metabolike flux ek nei S-adenosyl-1-methionine shunted wurde om de ynvestearring yn polyaminofenolamiden te regeljen. S-adenosyl-1-methionine is ET en in mienskiplike tuskenstof fan 'e polyamine-biosyntezepaad. It meganisme wêrmei't it ET-sinjaal it nivo fan fenolamide regelet, moat fierder ûndersocht wurde.
Troch it grutte oantal spesjale metaboliten mei in ûnbekende struktuer hat de yntinsive oandacht foar spesifike metabolike kategoryen lange tiid net by steat west om de tydlike feroarings fan metabolike ferskaat nei biologyske ynteraksjes strikt te beoardieljen. Op it stuit, basearre op ynformaasjeteory-analyze, is it wichtichste resultaat fan MS/MS-spektrumakwisysje basearre op ûnpartidige metaboliten dat herbivoaren dy't herbivoaren ite of simulearje, de algemiene metabolike ferskaat fan it blêdmetaboloom bliuwe ferminderje, wylst de spesjalisaasjegraad tanimt. Dizze tydlike ferheging fan metaboloomspesifisiteit feroarsake troch herbivoaren wurdt assosjeare mei in synergistyske ferheging fan transkriptoomspesifisiteit. It skaaimerk dat it meast bydraacht oan dizze gruttere metaboloomspesjalisaasje (mei in hegere Si-wearde) is de spesjale metaboliet mei de earder karakterisearre herbivoare funksje. Dit model is yn oerienstimming mei de foarsizzing fan OD-teory, mar de foarsizzing fan MT relatearre oan de willekeurigens fan metaboloomherprogrammearring is net konsekwint. Dizze gegevens binne lykwols ek yn oerienstimming mei de foarsizzing fan it mingde model (bêste MT; Figuer 1B), om't oare net-karakterisearre metaboliten mei ûnbekende ferdigeningsfunksjes noch in willekeurige Si-ferdieling kinne folgje.
In opmerklik patroan dat fierder troch dit ûndersyk fêstlein is, is dat fan it mikro-evolúsjenivo (ien plant en tabakspopulaasje) oant in gruttere evolúsjonêre skaal (nau besibbe tabaksoarten), ferskate nivo's fan evolúsjonêre organisaasje yn 'e "bêste ferdigening" binne. D'r binne wichtige ferskillen yn 'e kapasiteiten fan herbivoaren. Moore et al. (20) en Kessler en Kalske (1) hawwe ûnôfhinklik foarsteld om de trije funksjonele nivo's fan biodiversiteit dy't oarspronklik troch Whittaker (50) ûnderskieden waarden, om te setten yn 'e konstitutive en ynducearre tydlike feroarings fan gemyske ferskaat; dizze auteurs hawwe gjin gearfetting makke. De prosedueres foar grutskalige metabolome-gegevensferzameling jouwe ek net oan hoe't metabolike ferskaat út dizze gegevens berekkenje kin. Yn dizze stúdzje sille lytse oanpassingen oan 'e funksjonele klassifikaasje fan Whittaker α-metabolike ferskaat beskôgje as de ferskaat fan MS/MS-spektra yn in bepaalde plant, en β-metabolike ferskaat as it basis intraspesifike metabolisme fan in groep populaasjes Romte, en γ-metabolike ferskaat sil in útwreiding wêze fan 'e analyze fan ferlykbere soarten.
It JA-sinjaal is essensjeel foar in breed skala oan herbivoare metabolike reaksjes. D'r is lykwols in gebrek oan strang kwantitative testen fan 'e bydrage fan intraspesifike regeling fan JA-biosynteze oan metaboloomferskaat, en oft it JA-sinjaal in algemiene side is foar stress-induzearre metabolike diversifikaasje op in hegere makro-evolúsjonêre skaal is noch ûndúdlik. Wy hawwe waarnommen dat de herbivoare aard fan Nepenthes herbivorous metaboloomspesjalisaasje ynducearret en de fariaasje fan metaboloomspesjalisaasje binnen de populaasje fan Nicotiana-soarten en ûnder nau besibbe Nicotiana-soarten systematysk posityf korreleare is mei JA-sinjalearring. Derneist, as it JA-sinjaal beheind is, sil de metabolike spesifisiteit ynducearre troch in inkele genotype herbivoar annulearre wurde (Ofbylding 3, C en E). Om't de metabolike spektrumferoaringen fan 'e natuerlik ferswakke Nepenthes-populaasjes meast kwantitatyf binne, kinne de feroaringen yn 'e metabolike β-ferskaat en spesifisiteit yn dizze analyze foar in grut part feroarsake wurde troch de sterke eksitaasje fan metaboliet-rike ferbiningskategoryen. Dizze ferbiningsklassen dominearje in diel fan it metaboloomprofyl en liede ta in positive korrelaasje mei JA-sinjalen.
Omdat de biogemyske meganismen fan 'e nau besibbe tabaksoarten tige ferskillend binne, wurde de metaboliten spesifyk identifisearre yn it kwalitative aspekt, sadat it mear analytysk is. De ferwurking fan it fêstleine metabolike profyl troch ynformaasjeteory lit sjen dat herbivoaryske ynduksje de ôfwaging tusken metabolike gamma-ferskaat en spesjalisaasje fergruttet. It JA-sinjaal spilet in sintrale rol yn dizze ôfwaging. De tanimming fan metaboloomspesjalisaasje is yn oerienstimming mei de wichtichste OD-foarsizzing en is posityf korrelearre mei JA-sinjaal, wylst JA-sinjaal negatyf korrelearre is mei metabolike gamma-ferskaat. Dizze modellen jouwe oan dat de OD-kapasiteit fan planten benammen bepaald wurdt troch de plastisiteit fan JA, of it no op in mikro-evolúsjonêre skaal is of op in gruttere evolúsjonêre skaal. Eksogene JA-tapassingseksperiminten dy't JA-biosynteze-defekten omseilje, litte fierder sjen dat nau besibbe tabaksoarten ûnderskieden wurde kinne yn sinjaal-responsive en sinjaal-net-responsive soarten, krekt lykas har modus fan JA en metaboloomplastisiteit feroarsake troch herbivoaren. Sinjaal-net-responsive soarten kinne net reagearje fanwegen har ûnfermogen om endogene JA te produsearjen en binne dêrom ûnderwurpen oan fysiologyske beheiningen. Dit kin feroarsake wurde troch mutaasjes yn guon wichtige genen yn it JA-sinjaalpaad (AOS en JAR4 yn N. crescens). Dit resultaat beklammet dat dizze makro-evolúsjonêre patroanen tusken soarten benammen oandreaun wurde kinne troch feroaringen yn ynterne hormoanpersepsje en reaksjefermogen.
Neist de ynteraksje tusken planten en herbivoaren is de ferkenning fan metabolike ferskaatheid relatearre oan alle wichtige teoretyske foarútgong yn it ûndersyk nei biologyske oanpassing oan 'e omjouwing en de evolúsje fan komplekse fenotypyske eigenskippen. Mei de tanimming fan 'e hoemannichte gegevens dy't troch moderne MS-ynstruminten wurde sammele, kin hypotezetoetsing oer metabolike ferskaatheid no ferskillen tusken yndividuele/kategory-metaboliten oerstekke en globale analyze útfiere om ûnferwachte patroanen te iepenbierjen. Yn it proses fan grutskalige analyze is in wichtige metafoar it idee om betsjuttingsfolle kaarten te betinken dy't brûkt wurde kinne om gegevens te ferkennen. Dêrom is in wichtich resultaat fan 'e hjoeddeistige kombinaasje fan ûnpartidige MS/MS-metabolomika en ynformaasjeteory dat it in ienfâldige metriek leveret dy't brûkt wurde kin om kaarten te konstruearjen om de metabolike ferskaatheid op ferskate taksonomyske skalen te blêdzjen. It is de basiseasken fan dizze metoade. De stúdzje fan mikro/makro-evolúsje en mienskipsekology.
Op makro-evolúsjonêr nivo is de kearn fan 'e plant-ynsekt ko-evolúsjeteory fan Ehrlich en Raven (51) om te foarsizzen dat de fariaasje fan yntersoarte metabolike ferskaat de oarsaak is fan 'e diversifikaasje fan plantlinen. Yn 'e fyftich jier sûnt de publikaasje fan dit baanbrekkende wurk is dizze hypoteze lykwols selden hifke (52). Dit komt foar in grut part troch de fylogenetyske skaaimerken fan fergelykbere metabolike skaaimerken oer lange-ôfstân plantlinen. De seldsumheid kin brûkt wurde om doelanalysemetoaden te ferankeren. De hjoeddeiske MS/MS-workflow ferwurke troch ynformaasjeteory kwantifisearret de MS/MS strukturele oerienkomst fan ûnbekende metaboliten (sûnder foarôfgeande metabolietseleksje) en konvertearret dizze MS/MS'en yn in set fan MS/MS, sadwaande wurde yn profesjonele metabolisme Dizze makro-evolúsjonêre modellen fergelike yn klassifikaasjeskaal. Ienfâldige statistyske yndikatoaren. It proses is fergelykber mei fylogenetyske analyze, dy't sekwinsje-ôfstimming kin brûke om de snelheid fan diversifikaasje of karakterevolúsje te kwantifisearjen sûnder foarôfgeande foarsizzing.
Op biogemysk nivo lit de screeninghypotese fan Firn en Jones (53) sjen dat metabolike ferskaat op ferskate nivo's behâlden wurdt om grûnstoffen te leverjen om de biologyske aktiviteiten fan earder net-relatearre of ferfongen metaboliten út te oefenjen. Ynformaasjeteorymetoaden leverje in ramt wêryn dizze metaboliet-spesifike evolúsjonêre oergongen dy't foarkomme tidens metabolietspesjalisaasje kwantifisearre wurde kinne as ûnderdiel fan it foarstelde evolúsjonêre screeningproses: biologysk aktive oanpassing fan lege spesifisiteit nei hege spesifisiteit Ynhibearre metaboliten fan in bepaalde omjouwing.
Al mei al waarden yn 'e begjintiid fan molekulêre biology wichtige teoryen foar plantferdigening ûntwikkele, en deduktive hypoteze-oandreaune metoaden wurde breed beskôge as it ienige middel foar wittenskiplike foarútgong. Dit komt foar in grut part troch de technyske beheiningen fan it mjitten fan it heule metaboloom. Hoewol hypoteze-oandreaune metoaden benammen nuttich binne by it kiezen fan oare kausale meganismen, is har fermogen om ús begryp fan biogemyske netwurken te ferbetterjen beheinder as de berekkeningsmetoaden dy't op it stuit beskikber binne yn 'e hjoeddeiske data-yntinsive wittenskip. Dêrom falle teoryen dy't net foarsein wurde kinne fier bûten it berik fan beskikbere gegevens, sadat de hypotetyske formule/testsyklus fan foarútgong yn it ûndersyksfjild net ôfskaft wurde kin (4). Wy foarsizze dat de hjir yntrodusearre berekkeningsworkflow fan metabolomics de belangstelling foar de resinte (hoe) en definitive (wêrom) problemen fan metabolike ferskaat opnij kin oanwakkerje, en bydrage kin oan in nij tiidrek fan teoretysk begeliede datawittenskip. It tiidrek ûndersocht de wichtige teoryen dy't foargeande generaasjes ynspirearren.
Direkte herbivoarfieding wurdt útfierd troch in twadde stadium larve of Sl larve te kweken op in inkele bleekkleurige bekerplantblêd fan in inkele roasbloeiende plant, mei 10 plantreplikaten per plant. De ynsektenlarven waarden fêstklamme mei klemmen, en it oerbleaune blêdweefsel waard 24 en 72 oeren nei ynfeksje sammele en fluch beferzen, en de metaboliten waarden ekstrahearre.
Simulearje herbivoar behanneling op in tige syngronisearre manier. De metoade is om stofpatroanwielen te brûken om trije rigen toarnen oan elke kant fan 'e middenrib fan' e trije folslein útwreide blêden fan 'e plant te prikken tidens de groeifaze fan' e stofkrâns, en fuortendaliks 1:5 ferdunde Ms oan te bringen. Of brûk handschoende fingers om S1 OS yn 'e prikwûne yn te foegjen. Rispje en ferwurkje in blêd lykas hjirboppe beskreaun. Brûk de earder beskreaune metoade om primêre metaboliten en planthormonen te ekstrahearjen (54).
Foar eksogene JA-tapassingen wurde de trije petioleblêden fan elk fan 'e seis roazebloeiende planten fan elke soarte behannele mei 20μl lanolinepasta mei 150μg MeJA (Lan + MeJA), en 20μl lanoline plus wûnebehanneling (Lan + W), of brûk 20μl suvere lanoline as kontrôle. De blêden waarden 72 oeren nei de behanneling rispe, fluch beferzen yn floeibere stikstof, en opslein by -80°C oant gebrûk.
Fjouwer JA- en ET-transgene linen, nammentlik irAOC (36), irCOI1 (55), irACO en sETR1 (48), binne identifisearre yn ús ûndersyksgroep. irAOC liet in sterke ôfname sjen yn JA- en JA-Ile-nivo's, wylst irCOI1 net gefoelich wie foar JA's. Yn ferliking mei EV naam de JA-Ile-akkumulaasje ta. Op deselde wize sil irACO de produksje fan ET ferminderje, en yn ferliking mei EV sil sETR1, dat net gefoelich is foar ET, de produksje fan ET ferheegje.
In fotoakoestyske laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 real-time ET-sensor) wurdt brûkt om ET-mjitting net-invasyf út te fieren. Direkt nei de behanneling waard de helte fan 'e blêden ôfsnien en oerbrocht nei in fersegele glêzen fleske fan 4 ml, en de romte yn 'e holle mocht binnen 5 oeren opbouwe. Tidens de mjitting waard elk fleske 8 minuten lang trochspield mei in stream fan 2 liter/oere suvere loft, dy't earder troch in katalysator fan Sensor Sense gien wie om CO2 en wetter te ferwiderjen.
De microarray-gegevens waarden oarspronklik publisearre yn (35) en opslein yn 'e Gene Expression Comprehensive Database fan it National Center for Biotechnology Information (NCBI) (tagongsnûmer GSE30287). De gegevens dy't oerienkomme mei de blêden feroarsake troch de W + OSM-behanneling en de ûnbeskeadige kontrôle waarden ekstrahearre foar dizze stúdzje. De rûge yntensiteit is log2. Foar statistyske analyze waard de basisline omset en normalisearre nei syn 75e persintyl mei it R-softwarepakket.
De orizjinele RNA-sekwinsjegegevens (RNA-seq) fan Nicotiana-soarten waarden ophelle út it NCBI Short Reading Archives (SRA), projektnûmer is PRJNA301787, dat rapportearre waard troch Zhou et al. (39) en gean fierder lykas beskreaun yn (56). De rûge gegevens ferwurke troch W + W, W + OSM en W + OSS1 dy't oerienkomme mei Nicotiana-soarten waarden selektearre foar analyze yn dizze stúdzje, en ferwurke op de folgjende manier: Earst waarden de rûge RNA-seq-lêzingen omset yn FASTQ-formaat. HISAT2 konvertearret FASTQ nei SAM, en SAMtools konvertearret SAM-bestannen nei sortearre BAM-bestannen. StringTie wurdt brûkt om genekspresje te berekkenjen, en de ekspresjemetoade is dat d'r fragminten binne per tûzen basisfragminten per miljoen sekwinsjeare transkripsjefragminten.
De Acclaim chromatografyske kolom (150 mm x 2,1 mm; dieltsjegrutte 2,2 μm) dy't brûkt wurdt yn 'e analyze en de 4 mm x 4 mm beskermingskolom besteane út itselde materiaal. De folgjende binêre gradiënt wurdt brûkt yn it Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) systeem: 0 oant 0,5 minuten, isokratysk 90% A [deionisearre wetter, 0,1% (v/v) acetonitril en 0,05% mierensoer], 10% B (Acetonitril en 0,05% mierensoer); 0,5 oant 23,5 minuten, de gradiëntfaze is respektivelik 10% A en 90% B; 23,5 oant 25 minuten, isokratysk 10% A en 90% B. De streamsnelheid is 400 μl/min. Foar alle MS-analyses, ynjeksjearje it kolom-eluent yn in quadrupool- en time-of-flight (qTOF)-analysator foarsjoen fan in elektrosprayboarne dy't wurket yn positive ionisaasjemodus (kapillêre spanning, 4500 V; kapillêre útgong 130 V; droechtemperatuer 200 °C; droechluchtstream 10 liter/min).
Fier MS/MS-fragmintanalyse út (hjirnei oantsjutten as MS/MS) dy't irrelevant is of net te ûnderskieden is fan 'e gegevens om strukturele ynformaasje te krijen oer it algemiene detektearbere metabolike profyl. It konsept fan 'e ûnûnderskiedende MS/MS-metoade is basearre op it feit dat de quadrupool in heul grut massa-isolaasjefinster hat [beskôgje dêrom alle massa-oant-ladingferhâlding (m/z) sinjalen as fragminten]. Om dizze reden, om't it Impact II-ynstrumint gjin CE-kanteling koe oanmeitsje, waarden ferskate ûnôfhinklike analyses útfierd mei ferhege botsing-induzearre dissosiaasjebotsingsenerzjy (CE) wearden. Koartsein, analysearje earst it stekproef troch UHPLC-elektrospray-ionisaasje/qTOF-MS mei ienige massaspektrometrymodus (lege fragmintaasjeomstannichheden generearre troch fragmintaasje yn 'e boarne), scannen fan m/z 50 oant 1500 by in werhellingsfrekwinsje fan 5 Hz. Brûk stikstof as it botsingsgas foar MS/MS-analyse, en fier ûnôfhinklike mjittingen út by de folgjende fjouwer ferskillende botsing-induzearre dissosiaasjespanningen: 20, 30, 40 en 50 eV. Tidens it mjitproses hat de quadrupool it grutste massa-isolaasjefinster, fan m/z 50 oant 1500. As it m/z-eksperimint fan it foarste lichem en de isolaasjebreedte ynsteld binne op 200, wurdt it massaberik automatysk aktivearre troch de bestjoeringssoftware fan it ynstrumint en 0 Da. Skanne op massafragminen lykas yn ienmassamodus. Brûk natriumformiaat (50 ml isopropanol, 200 μl mierensoer en 1 ml 1M NaOH wetterige oplossing) foar massakalibraasje. Mei it hege-presyzje kalibraasjealgoritme fan Bruker wurdt it gegevensbestân kalibrearre nei it útfieren fan it gemiddelde spektrum yn in bepaalde perioade. Brûk de eksportfunksje fan Data Analysis v4.0-software (Brook Dalton, Bremen, Dútslân) om de rûge gegevensbestannen te konvertearjen nei NetCDF-formaat. De MS/MS-dataset is bewarre yn 'e iepen metabolomics-database MetaboLights (www.ebi.ac.uk) mei it tagongsnûmer MTBLS1471.
MS/MS-assemblage kin realisearre wurde troch korrelaasje-analyze tusken MS1- en MS/MS-kwaliteitssignalen foar lege en hege botsingsenerzjy en nij ymplementearre regels. It R-skript wurdt brûkt om de korrelaasje-analyze fan 'e ferdieling fan' e foargonger fan it produkt te realisearjen, en it C#-skript (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) wurdt brûkt om de regels te ymplementearjen.
Om falsk-positive flaters te ferminderjen feroarsake troch eftergrûnlûd en falske korrelaasje feroarsake troch it detektearjen fan bepaalde m/z-funksjes yn mar in pear samples, brûke wy de "filled peak"-funksje fan it R-pakket XCMS (foar eftergrûnlûdskorreksje). Moat brûkt wurde om de "NA" (ûndetektearre peak) yntensiteit te ferfangen. As de fill peak-funksje brûkt wurdt, binne d'r noch in protte "0" yntensiteitswearden yn 'e dataset dy't de korrelaasjeberekkening sille beynfloedzje. Dan fergelykje wy de gegevensferwurkingsresultaten dy't krigen binne as de filled peak-funksje brûkt wurdt en as de filled peak-funksje net brûkt wurdt, en berekkenje de eftergrûnlûdwearde op basis fan 'e gemiddelde korrizjearre skatte wearde, en ferfange dan dizze 0-yntensiteitswearden mei de berekkene eftergrûnwearde. Wy hawwe ek allinich funksjes beskôge wêrfan de yntensiteit trije kear de eftergrûnwearde oerstie en se beskôge as "wiere pieken". Foar PCC-berekkeningen wurde allinich de m/z-sinjalen fan 'e sampleprecursor (MS1) en fragmintdatasets mei teminsten acht wiere pieken beskôge.
As de yntensiteit fan 'e foargongerkwaliteitsfunksje yn it heule stekproef signifikant korrelearret mei de fermindere yntensiteit fan itselde kwaliteitsfunksje dat ûnderwurpen wurdt oan lege of hege botsingsenerzjy, en it skaaimerk net troch CAMERA as in isotooppiek markearre wurdt, kin it fierder definieare wurde. Dan, troch alle mooglike foargonger-produktpearen binnen 3 s te berekkenjen (it skatte retinsjetiidfinster foar piekretinsje), wurdt de korrelaasje-analyze útfierd. Allinnich as de m/z-wearde leger is as de foargongerwearde en MS/MS-fragmintaasje foarkomt op deselde stekproeflokaasje yn 'e dataset as de foargonger wêrfan it ôflaat is, wurdt it beskôge as in fragmint.
Op basis fan dizze twa ienfâldige regels slute wy de oantsjutte fragminten út mei m/z-wearden grutter as de m/z fan 'e identifisearre foargonger, en op basis fan 'e stekproefposysje wêr't de foargonger ferskynt en it oantsjutte fragmint. It is ek mooglik om de kwaliteitsfunksjes te selektearjen dy't generearre binne troch in protte yn-boarnefragminten generearre yn MS1-modus as kandidaat-foargongers, wêrtroch redundante MS/MS-ferbiningen generearre wurde. Om dizze gegevensredundânsje te ferminderjen, as de NDP-oerienkomst fan 'e spektra mear as 0.6 is, en se hearre ta it chromatogram "pcgroep" annotearre troch CAMERA, sille wy se gearfoegje. Uteinlik fusearje wy alle fjouwer CE-resultaten dy't ferbûn binne mei de foargonger en fragminten yn it definitive dekonvolutearre gearstalde spektrum troch de pyk mei de heechste yntensiteit te selektearjen ûnder alle kandidaatpieken mei deselde m/z-wearde by ferskate botsingsenerzjy's. De folgjende ferwurkingstappen binne basearre op it konsept fan gearstald spektrum en hâlde rekken mei de ferskate CE-omstannichheden dy't nedich binne om de kâns op fragmintaasje te maksimalisearjen, om't guon fragminten allinich kinne wurde ûntdutsen ûnder in spesifike botsingsenerzjy.
RDPI (30) waard brûkt om de yndusearberens fan it metabolike profyl te berekkenjen. De metabolike spektrumferskaat (Hj-yndeks) wurdt ôflaat fan 'e oerfloed fan MS/MS-foarrinners mei help fan 'e Shannon-entropie fan 'e MS/MS-frekwinsjeferdieling mei help fan 'e folgjende fergeliking beskreaun troch Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) wêrby't Pij oerienkomt mei de relative frekwinsje fan 'e i-de MS/MS yn it j-de stekproef (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolyske spesifisiteit (Si-yndeks) wurdt definiearre as de ekspresje-identiteit fan in opjûne MS/MS yn relaasje ta de frekwinsje tusken de samples dy't beskôge wurde. MS/MS-spesifisiteit wurdt berekkene as Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Brûk de folgjende formule om de metaboloom-spesifike δj-yndeks fan elk j-monster te mjitten, en it gemiddelde fan MS/MS-spesifisiteit δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektra wurde yn pearen ôfstimd, en de oerienkomst wurdt berekkene op basis fan 'e twa skoares. Earst, mei help fan standert NDP (ek wol bekend as kosinuskorrelaasjemetoade), brûk de folgjende fergeliking om de segmentoerienkomst tusken spektra te skoaren: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 wêrby't S1 en S2 Oerienkommende, foar spektrum 1 en spektrum 2, lykas WS1, i en WS2, fertsjintwurdiget i it gewicht basearre op 'e peakintensiteit wêrby't it ferskil fan 'e i-de mienskiplike pyk tusken de twa spektra minder is as 0,01 Da. It gewicht wurdt as folget berekkene: W = [peakintensiteit] m [kwaliteit] n, m = 0,5, n = 2, lykas suggerearre troch MassBank.
In twadde skoaremetoade waard ymplementearre, dy't it analysearjen fan 'e dielde NL tusken MS/MS omfette. Hjirfoar hawwe wy de 52 NL-listen dy't faak tsjinkomme tidens it MS-fragmentaasjeproses yn tandem brûkt, en de mear spesifike NL (databestân S1) dy't earder annotearre is foar it MS/MS-spektrum fan 'e sekundêre metaboliten fan 'e ferswakke Nepenthes-soarte (9, 26). Meitsje in binêre fektor fan 1 en 0 foar elke MS/MS, dy't oerienkomt mei de hjoeddeiske en net-besteande fan guon NL respektivelik. Op basis fan 'e Euklidyske ôfstânsoerienkomst wurdt de NL-oerienkomstskoare berekkene foar elk pear binêre NL-fektoren.
Om dûbele klustering út te fieren, hawwe wy it R-pakket DiffCoEx brûkt, dat basearre is op in útwreiding fan Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Mei de NDP- en NL-skoarmatrices fan MS/MS-spektra hawwe wy DiffCoEx brûkt om de ferlykjende korrelaasjematrix te berekkenjen. Binêre klustering wurdt útfierd troch de parameter "cutreeDynamic" yn te stellen op method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, en minClusterSize = 10. De R-boarnekoade fan DiffCoEx waard downloade fan ekstra bestân 1 troch Tesson et al. (57); It fereaske R WGCNA-softwarepakket is te finen yn https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Om MS/MS molekulêre netwurkanalyse út te fieren, hawwe wy pearde spektrale ferbining berekkene op basis fan NDP- en NL-oerienkomsttypen, en Cytoscape-software brûkt om netwurktopology te visualisearjen mei organyske yndieling yn 'e CyFilescape yFiles-yndielingsalgoritme-útwreidingsapplikaasje.
Brûk R ferzje 3.0.1 om statistyske analyze út te fieren op 'e gegevens. Statistyske betsjutting waard beoardiele mei twa-wei fariânsjeanalyse (ANOVA), folge troch Tukey's honestly significant difference (HSD) post-hoc test. Om it ferskil tusken de herbivore behanneling en de kontrôle te analysearjen, waard de twasidige ferdieling fan 'e twa groepen samples mei deselde fariânsje analysearre mei Student's t-test.
Foar oanfoljende materialen foar dit artikel, sjoch http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Dit is in iepen tagongsartikel ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, dy't it gebrûk, de distribúsje en de reproduksje yn elk medium tastiet, salang't it definitive gebrûk net foar kommersjeel gewin is en it útgongspunt is dat it orizjinele wurk korrekt is. Referinsje.
Opmerking: Wy freegje jo allinich om jo e-mailadres op te jaan, sadat de persoan dy't jo oanbefelje oan 'e pagina wit dat jo wolle dat se de e-mail sjogge en dat it gjin spam is. Wy sille gjin e-mailadressen fêstlizze.
Dizze fraach wurdt brûkt om te testen oft jo in besiker binne en automatyske spamferstjoering te foarkommen.
Ynformaasjeteory biedt in universele munt foar de fergeliking fan spesjale metabolomen en de foarsizzing fan testferdigeningsteoryen.
Ynformaasjeteory biedt in universele munt foar de fergeliking fan spesjale metabolomen en de foarsizzing fan testferdigeningsteoryen.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rjochten foarbehâlden. AAAS is in partner fan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.