It artikel makket diel út fan it ûndersyksûnderwerp "Ferbetterjen fan 'e wjerstân fan peulvruchten tsjin patogenen en pleagen", besjoch alle 5 artikels
De oarsaaklike agint fan 'e skimmelsykte nekrose Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary brûkt in mearlaachse strategy om ferskate gasthearplanten te ynfektearjen. Dizze stúdzje stelt it gebrûk foar fan it diamine L-ornithine, in net-proteïne-aminosoer dat de synteze fan oare essensjele aminosoeren stimulearret, as in alternative behearstrategy om de molekulêre, fysiologyske en biogemyske reaksjes fan Phaseolus vulgaris L. op wite skimmel feroarsake troch Pseudomonas sclerotiorum te ferbetterjen. In vitro-eksperiminten lieten sjen dat L-ornithine de myceliale groei fan S. pyrenoidosa signifikant remde op in dosisôfhinklike manier. Boppedat koe it de earnst fan wite skimmel ûnder kasomstannichheden signifikant ferminderje. Fierder stimulearre L-ornithine de groei fan 'e behannele planten, wat oanjout dat de testte konsintraasjes fan L-ornithine net fytotoksysk wiene foar de behannele planten. Derneist fersterke L-ornithine de ekspresje fan net-enzymatyske antioksidanten (totaal oplosbere fenolen en flavonoïden) en enzymatyske antioksidanten (katalase (CAT), peroxidase (POX), en polyfenoloksidase (PPO)), en fergrutte de ekspresje fan trije antioksidant-relatearre genen (PvCAT1, PvSOD, en PvGR). Fierder die bliken út in silico-analyze de oanwêzigens fan in fertochte oksaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) proteïne yn it S. sclerotiorum-genoom, dy't tige ferlykber wie mei de oksaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) proteïnen fan Aspergillus fijiensis (AfOAH) en Penicillium sp. (PlOAH) yn termen fan funksjonele analyze, konservearre domeinen, en topology. Nijsgjirrich is dat de tafoeging fan L-ornithine oan ierappeldextrosebouillon (PDB) medium de ekspresje fan it SsOAH-gen yn S. sclerotiorum-mycelia signifikant fermindere. Op deselde wize fermindere eksogene tapassing fan L-ornithine de ekspresje fan it SsOAH-gen yn skimmelmycelia sammele fan behannele planten signifikant. Uteinlik fermindere L-ornithine-tapassing de oksaalsoersekresje signifikant yn sawol PDB-medium as ynfekteare blêden. Konklúzjend spilet L-ornithine in wichtige rol by it behâld fan 'e redoksstatus en it ferbetterjen fan 'e ferdigeningsreaksje fan ynfekteare planten. De resultaten fan dizze stúdzje kinne helpe by it ûntwikkeljen fan ynnovative, miljeufreonlike metoaden om wite skimmel te kontrolearjen en de ynfloed dêrfan op beanproduksje en oare gewaaksen te ferminderjen.
Wite skimmel, feroarsake troch de nekrotrofyske skimmel Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, is in ferneatigjende, opbringstferminderjende sykte dy't in serieuze bedriging foarmet foar de wrâldwide produksje fan beanen (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum is ien fan 'e dregste boaiemfergiftige skimmelplantpatogenen om te kontrolearjen, mei in breed gasthearberik fan mear as 600 plantesoarten en it fermogen om gasthearweefsels fluch te ferbaarnen op in net-spesifike manier (Liang en Rollins, 2018). Under ûngeunstige omstannichheden ûndergiet it in krityske faze fan syn libbensyklus, wêrby't it lange perioaden sliepend bliuwt as swarte, hurde, sied-achtige struktueren neamd 'sklerotia' yn 'e boaiem of as wite, pluizige groeisels yn it mycelium of stammerm fan ynfekteare planten (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum is by steat om sclerotie te foarmjen, wêrtroch't it lange perioaden yn ynfekteare fjilden oerlibje kin en tidens sykte oanhâlde kin (Schwartz et al., 2005). Sklerotie binne ryk oan fiedingsstoffen, kinne lange perioaden yn 'e boaiem oanhâlde en tsjinje as it primêre ynokulum foar folgjende ynfeksjes (Schwartz et al., 2005). Under geunstige omstannichheden ûntkieme sclerotie en produsearje loftborne spoaren dy't alle boppegrûnske dielen fan 'e plant ynfektearje kinne, ynklusyf mar net beheind ta blommen, stielen of peulen (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum brûkt in mearlaachse strategy om har gasthearplanten te ynfektearjen, wêrby't in searje koördinearre barrens belutsen binne, fan sklerotiale kimen oant symptoomûntwikkeling. Yn it earstoan produseart S. sclerotiorum suspendearre sporen (ascosporen neamd) út paddestoelachtige struktueren dy't apothecia neamd wurde, dy't yn 'e loft telâne komme en ûntwikkelje ta net-beweglike sklerotia op ynfekteare plantôffal (Bolton et al., 2006). De skimmel skiedt dan oksaalsoer út, in virulinsjefaktor, om de pH fan 'e plantselwand te kontrolearjen, enzymatyske ôfbraak en weefselynvaazje te befoarderjen (Hegedus en Rimmer, 2005), en de oksidative útbarsting fan 'e gasthearplant te ûnderdrukken. Dit fersuringsproses ferswakket de plantselwand, wêrtroch in geunstige omjouwing ûntstiet foar de normale en effisjinte wurking fan skimmelselwand-ôfbrekkende enzymen (CWDE's), wêrtroch't de patogeen de fysike barriêre oerwinne kin en de gasthearweefsels penetrearje kin (Marciano et al., 1983). As it ienris penetrearre is, skiedt S. sclerotiorum in oantal CWDE's út, lykas polygalacturonase en cellulase, dy't de fersprieding yn ynfekteare weefsels fasilitearje en weefselnekrose feroarsaakje. De foarútgong fan laesjes en hyfenmatten liedt ta de karakteristike symptomen fan wite skimmel (Hegedus en Rimmer, 2005). Underwilens werkenne gasthearplanten patogeen-assosjeare molekulêre patroanen (PAMP's) fia patroanherkenningsreseptoren (PRR's), wêrtroch in searje sinjalearingsbarrens triggerje dy't úteinlik ferdigeningsreaksjes aktivearje.
Nettsjinsteande tsientallen jierren fan syktekontrôle-ynspanningen bliuwe tekoarten oan foldwaande resistente kiemplasma yn beanen, lykas yn oare kommersjele gewaaksen, fanwegen de wjerstân, oerlibjensfermogen en oanpassingsfermogen fan 'e patogeen. Syktebehear is dêrom ekstreem útdaagjend en fereasket in yntegreare, mearfâldige strategy dy't in kombinaasje fan kulturele praktiken, biologyske kontrôle en gemyske fungiciden omfettet (O'Sullivan et al., 2021). Gemyske kontrôle fan wite skimmel is it meast effektyf, om't fungiciden, as se goed en op it juste momint tapast wurde, de fersprieding fan 'e sykte effektyf kinne kontrolearje, de earnst fan ynfeksje ferminderje en opbringstferlies minimalisearje. Oermjittich gebrûk en tefolle ôfhinklikens fan fungiciden kin lykwols liede ta it ûntstean fan resistente stammen fan S. sclerotiorum en in negative ynfloed hawwe op net-doelorganismen, boaiemsûnens en wetterkwaliteit (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Dêrom is it finen fan miljeufreonlike alternativen in topprioriteit wurden.
Polyaminen (PA's), lykas putrescine, spermidine, spermine en cadaverine, kinne tsjinje as belofte alternativen tsjin boaiemfergiftige plantpatogenen, wêrtroch it gebrûk fan gefaarlike gemyske fungiciden folslein of foar in part fermindere wurdt (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Yn hegere planten binne PA's belutsen by in protte fysiologyske prosessen, ynklusyf, mar net beheind ta, seldieling, differinsjaasje en reaksje op abiotyske en biotyske stress (Killiny en Nehela, 2020). Se kinne fungearje as antioksidanten, helpe by it opfangen fan reaktive soerstofsoarten (ROS), redokshomeostase behâlde (Nehela en Killiny, 2023), ferdigeningsrelatearre genen indusearje (Romero et al., 2018), ferskate metabolike paden regelje (Nehela en Killiny, 2023), endogene fytohormonen modulearje (Nehela en Killiny, 2019), systemyske ferworven ferset (SAR) fêstigje, en plant-patogeen-ynteraksjes regelje (Nehela en Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). It is it neamen wurdich dat de spesifike meganismen en rollen fan PA's yn plantferdigening ferskille ôfhinklik fan plantesoarten, patogenen en miljeu-omstannichheden. De meast foarkommende PA yn planten wurdt biosynthetisearre út it essensjele polyamine L-ornithine (Killiny en Nehela, 2020).
L-ornithine spilet meardere rollen yn plantgroei en ûntwikkeling. Bygelyks, eardere stúdzjes hawwe oantoand dat yn rys (Oryza sativa) ornithine assosjeare wurde kin mei stikstofrecycling (Liu et al., 2018), rysopbringst, kwaliteit en aroma (Lu et al., 2020), en wetterstressreaksje (Yang et al., 2000). Fierder ferbettere eksogene tapassing fan L-ornithine de droechtetolerânsje yn sûkerbieten (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) signifikant en fermindere sâltstress yn sipel- (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu en Çavuşoǧlu, 2021) en cashew- (Anacardium occidentale) planten (da Rocha et al., 2012). De potinsjele rol fan L-ornithine yn abiotyske stressferdigening kin te tankjen wêze oan syn belutsenens by proline-akkumulaasje yn behannele planten. Bygelyks, genen dy't relatearre binne oan prolinemetabolisme, lykas ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) en proline dehydrogenase (ProDH1 en ProDH2) genen, binne earder rapportearre as belutsen by de ferdigening fan Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana tsjin net-gasthear Pseudomonas syringae-stammen (Senthil-Kumar en Mysore, 2012). Oan 'e oare kant is skimmel ornithine decarboxylase (ODC) fereaske foar patogeengroei (Singh et al., 2020). It rjochtsjen op ODC fan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici fia gasthear-induzearre genstilmeitsjen (HIGS) fergrutte de wjerstân fan tomatenplanten tsjin Fusarium-ferwelking signifikant (Singh et al., 2020). De potinsjele rol fan eksogene ornithine-tapassing tsjin biotyske stressfaktoren lykas fytopathogenen is lykwols net goed bestudearre. Wichtiger is dat de effekten fan ornithine op sykteferset en de assosjearre biogemyske en fysiologyske ferskynsels foar in grut part ûnûndersocht bliuwe.
It begripen fan 'e kompleksiteit fan S. sclerotiorum-ynfeksje fan peulvruchten is wichtich foar de ûntwikkeling fan effektive kontrôlestrategyen. Yn dizze stúdzje hawwe wy besocht de potinsjele rol fan 'e diamine L-ornithine te identifisearjen as in wichtige faktor yn it ferbetterjen fan 'e ferdigeningsmeganismen en wjerstân fan peulvruchten tsjin Sclerotinia sclerotiorum-ynfeksje. Wy stelle de hypoteze dat, neist it ferbetterjen fan 'e ferdigeningsreaksjes fan ynfekteare planten, L-ornithine ek in wichtige rol spilet by it behâld fan 'e redoksstatus. Wy stelle foar dat de potinsjele effekten fan L-ornithine relatearre binne oan 'e regeling fan enzymatyske en net-enzymatyske antioxidant-ferdigeningsmeganismen en ynterferinsje mei skimmelpatogeniteit/virulinsjefaktoaren en assosjearre proteïnen. Dizze dûbele funksjonaliteit fan L-ornithine makket it in belofte kandidaat foar in duorsume strategy om de ynfloed fan wite skimmel te ferminderjen en de wjerstân fan gewoane peulvruchtengewaaksen tsjin dizze krêftige skimmelpatogeen te ferbetterjen. De resultaten fan 'e hjoeddeiske stúdzje kinne helpe by de ûntwikkeling fan ynnovative, miljeufreonlike metoaden om wite skimmel te kontrolearjen en de ynfloed dêrfan op peulvruchtenproduksje te ferminderjen.
Yn dizze stúdzje waard in gefoelige kommersjele fariëteit fan gewoane bean, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), brûkt as eksperiminteel materiaal. Sûne siedden waarden freonlik levere troch de Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypte. Fiif siedden waarden siedde yn plestik potten (binnendiameter 35 sm, djipte 50 sm) fol mei S. sclerotiorum-ynfekteare boaiem ûnder kasomstannichheden (25 ± 2 °C, relative fochtigens 75 ± 1%, 8 oeren ljocht/16 oeren tsjuster). 7-10 dagen nei it siedzjen (DPS) waarden de siedlingen útdûn om mar twa siedlingen mei unifoarme groei en trije folslein útwreide blêden yn elke pot oer te litten. Alle potplanten waarden ien kear yn 'e twa wiken wetterd en moanliks bemeste mei de oanrikkemandearre hoemannichte foar de opjûne fariëteit.
Om in konsintraasje fan 500 mg/L fan L-ornithinediamine (ek wol bekend as (+)-(S)-2,5-diaminopentaansoer; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Dútslân) ta te rieden, waard earst 50 mg oplost yn 100 mL steryl destillearre wetter. De stockoplossing waard doe ferdund en brûkt yn folgjende eksperiminten. Koartsein waarden seis searjes fan L-ornithine-konsintraasjes (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) yn vitro test. Derneist waard steryl destillearre wetter brûkt as in negative kontrôle (Mock) en waard it kommersjele fungicide "Rizolex-T" 50% wietbere poeier (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypte) brûkt as in positive kontrôle. It kommersjele fungicide "Rizolex-T" waard yn vitro test op fiif konsintraasjes (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L).
Monsters fan gewoane beanestammen en peulen dy't typyske symptomen fan wite skimmel sjen litte (ynfestaasjegraad: 10–30%) waarden sammele fan kommersjele pleatsen. Hoewol't it measte fan 'e ynfekteare plantmaterialen identifisearre waarden troch soarte/fariëteit (gefoelige kommersjele fariëteit Giza 3), wiene oaren, benammen dyjingen dy't fan lokale merken krigen waarden, fan ûnbekende soarten. De sammele ynfekteare materialen waarden earst oerflakdesinfeksjeare mei 0,5% natriumhypochlorietoplossing foar 3 minuten, doe ferskate kearen spield mei steryl destillearre wetter en droechwiske mei steryl filterpapier om oerstallich wetter te ferwiderjen. De ynfekteare organen waarden doe yn lytse stikken snien fan it middelste weefsel (tusken sûne en ynfekteare weefsels), kultivearre op ierappeldextrose-agar (PDA) medium en ynkubearre by 25 ± 2 °C mei in 12 oeren ljocht/12 oeren tsjustersyklus foar 5 dagen om sclerotia-foarming te stimulearjen. De myceliumtipmetoade waard ek brûkt om skimmelisolaten te suverjen fan mingde of fersmoarge kultueren. It suvere skimmelisolaat waard earst identifisearre op basis fan syn kulturele morfologyske skaaimerken en doe befêstige as S. sclerotiorum op basis fan mikroskopyske skaaimerken. Uteinlik waarden alle suvere isolaten hifke op patogeniteit op 'e gefoelige gewoane beankultivar Giza 3 om te foldwaan oan 'e postulaten fan Koch.
Derneist waard it meast invasive S. sclerotiorum-isolaat (isolaat #3) fierder befêstige op basis fan ynterne transkribearre spacer (ITS) sekwinsjearring lykas beskreaun troch White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Koartsein waarden isolaten kultivearre yn ierappeldextrosebouillon (PDB) en ynkubearre by 25 ± 2 °C foar 5-7 dagen. Skimmelmycelium waard doe sammele, filtere troch tsiisdoek, twa kear wosken mei steryl wetter en droege mei steryl filterpapier. Genomysk DNA waard isolearre mei de Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). De ITS rDNA-regio waard doe amplifisearre mei it spesifike primerpear ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ferwachte grutte: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). De suvere PCR-produkten waarden yntsjinne foar sekwinsjearring (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). De ITS rDNA-sekwinsjes waarden bidireksjoneel sekwinsjearre mei de Sanger-sekwinsjearringsmetoade. De gearstalde query-sekwinsjes waarden doe fergelike mei de lêste gegevens yn GenBank en it National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) mei help fan BLASTn-software. De query-sekwinsje waard fergelike mei 20 oare S. sclerotiorum-stammen/isolaten dy't ophelle binne út de lêste gegevens yn NCBI GenBank (Oanfoljende tabel S1) mei help fan ClustalW yn it Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; ferzje 11) (Kumar et al., 2024). Evolúsjonêre analyze waard útfierd mei de maksimale likelihood-metoade en it algemiene tiid-omkearbere nukleotide-substituasjemodel (Nei en Kumar, 2000). De beam mei de heechste log-likelihood wurdt werjûn. De earste beam foar de heuristyske sykaksje wurdt selektearre troch de beam mei de hegere log-likelihood te kiezen tusken de neighbor-joining (NJ) beam (Kumar et al., 2024) en de maksimale parsimony (MP) beam. De NJ-beam waard konstruearre mei in pearwize ôfstânmatrix berekkene mei it algemiene tiid-omkearbere model (Nei en Kumar, 2000).
De antibakteriële aktiviteit fan L-ornithine en it bakteriside "Rizolex-T" waard yn vitro bepaald mei de agardiffúzjemetoade. Metoade: Nim de passende hoemannichte fan 'e stockoplossing fan L-ornithine (500 mg/L) en ming it goed mei 10 ml fan it PDA-fiedingsmedium om oplossingen te meitsjen mei definitive konsintraasjes fan respektivelik 12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L. Fiif konsintraasjes fan it fungicide "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L) en steryl destillearre wetter waarden brûkt as kontrôle. Nei't it medium stold wie, waard in farske myceliumprop fan Sclerotinia sclerotiorum-kultuer, 4 mm yn diameter, oerbrocht nei it midden fan 'e petriskûtel en kultivearre by 25±2°C oant it mycelium de heule kontrôle-petriskûtel bedekte, wêrnei't de skimmelgroei waard registrearre. Berekenje it persintaazje ynhibysje fan radiale groei fan S. sclerotiorum mei help fan fergeliking 1:
It eksperimint waard twa kear werhelle, mei seis biologyske replikaten foar elke kontrôle-/eksperimintele groep en fiif potten (twa planten per pot) foar elke biologyske replikaat. Elke biologyske replikaat waard twa kear analysearre (twa technyske replikaten) om de krektens, betrouberens en reprodusearberens fan 'e eksperimintele resultaten te garandearjen. Derneist waard probit-regresje-analyze brûkt om de heal-maksimale remmende konsintraasje (IC50) en IC99 te berekkenjen (Prentice, 1976).
Om it potinsjeel fan L-ornithine ûnder broeikasomstannichheden te evaluearjen, waarden twa opienfolgjende poteksperiminten útfierd. Koartsein waarden potten fol mei sterilisearre klaai-sângrûn (3:1) en yninting mei in farske tariede kultuer fan S. sclerotiorum. Earst waard it meast invasive isolaat fan S. sclerotiorum (isolaat #3) kultivearre troch ien sclerotium yn 'e helte te snijen, it mei de foarkant nei ûnderen op in PDA te lizzen en 4 dagen by 25 °C yn konstante tsjuster (24 oeren) te ynkubearjen om myceliumgroei te stimulearjen. Fjouwer agarpluggen mei in diameter fan 5 mm waarden doe fan 'e foarrâne nommen en yninting mei 100 g fan in sterile mingsel fan weet en ryssemels (1:1, v/v) en alle flessen waarden 5 dagen by 25 ± 2 °C ynkubearre ûnder in 12 oeren ljocht/12 oeren tsjustersyklus om sclerotiafoarming te stimulearjen. De ynhâld fan alle flessen waard goed mingd om homogeniteit te garandearjen foardat grûn tafoege waard. Doe waard 100 g fan it kolonisearjende semelsmingsel oan elke pot tafoege om in konstante konsintraasje fan patogenen te garandearjen. De yninte potten waarden wetterd om skimmelgroei te aktivearjen en 7 dagen yn broeikasomstannichheden pleatst.
Fiif siedden fan 'e Giza 3-fariant waarden doe yn elke pot siedde. Foar de potten behannele mei L-ornithine en it fungicide Rizolex-T waarden de sterilisearre siedden earst twa oeren wekt yn in wetterige oplossing fan 'e twa ferbiningen mei in definitive IC99-konsintraasje fan respektivelik sawat 250 mg/L en 50 mg/L, en doe ien oere oan 'e loft droege foar it siedzjen. Oan 'e oare kant waarden de siedden wekt yn steryl destillearre wetter as in negative kontrôle. Nei 10 dagen, foar it earste wetterjen, waarden de siedlingen útdûn, wêrtroch't der mar twa skjinne siedlingen yn elke pot oerbleaune. Derneist, om ynfeksje mei S. sclerotiorum te garandearjen, waarden beanplantestammen yn itselde ûntwikkelingsstadium (10 dagen) op twa ferskillende lokaasjes ôfsnien mei in sterilisearre skalpel en sawat 0,5 g fan it kolonisearjende semelsmingsel waard yn elke wûne pleatst, folge troch hege fochtigens om ynfeksje en sykteûntwikkeling yn alle yninte planten te stimulearjen. Kontrôleplanten waarden op deselde wize ferwûne en in gelikense hoemannichte (0,5 g) fan in sterile, net-kolonisearre semelsmingsel waard yn 'e wûne pleatst en ûnder hege fochtigens hâlden om de omjouwing foar sykteûntwikkeling te simulearjen en konsistinsje tusken behannelinggroepen te garandearjen.
Behannelingsmetoade: Beansiedlings waarden wetterd mei 500 ml fan in wetterige oplossing fan L-ornithine (250 mg/l) of it fungicide Rizolex-T (50 mg/l) troch de boaiem te irrigearjen, dêrnei waard de behanneling trije kear werhelle mei in ynterval fan 10 dagen. De mei placebo behannele kontrôles waarden irrigearre mei 500 ml steryl destillearre wetter. Alle behannelingen waarden útfierd ûnder broeikasomstannichheden (25 ± 2 °C, 75 ± 1% relative fochtigens, en in fotoperioade fan 8 oeren ljocht/16 oeren tsjuster). Alle potten waarden twa-wiken wetterd en moanliks behannele mei in lykwichtige NPK-dongstof (20-20-20, mei 3,6% swevel en TE-mikroeleminten; Zain Seeds, Egypte) yn in konsintraasje fan 3-4 g/l troch blêdspuiten neffens de oanbefellings foar de spesifike fariëteit en de ynstruksjes fan 'e fabrikant. Behalven as oars oanjûn, waarden folslein útwreide folwoeksen blêden (2e en 3e blêden fan boppen) sammele fan elke biologyske replikaat 72 oeren nei behanneling (hpt), homogenisearre, gearfoege en opslein by -80 °C foar fierdere analyses, ynklusyf, mar net beheind ta, in situ histochemyske lokalisaasje fan oksidative stressindikatoaren, lipideperoksidaasje, enzymatyske en net-enzymatyske antioksidanten en genekspresje.
De yntensiteit fan wite skimmelynfeksje waard wykliks 21 dagen nei yninting (dpi) beoardiele mei in skaal fan 1–9 (Oanfoljende tabel S2) basearre op 'e skaal fan Petzoldt en Dickson (1996) oanpast troch Teran et al. (2006). Koartsein waarden de stielen en tûken fan beanplanten ûndersocht begjinnend by it ynintingspunt om de foarútgong fan laesjes lâns ynternodiën en knopen te folgjen. De ôfstân fan 'e laesje fan it ynintingspunt oant it fierste punt lâns de stiel of tûke waard doe metten en in skoare fan 1–9 waard tawiisd op basis fan 'e lokaasje fan 'e laesje, wêrby't (1) gjin sichtbere ynfeksje tichtby it ynintingspunt oanjûn en (2–9) in stadige tanimming fan laesjegrutte en foarútgong lâns knopen/ynternodiën oanjûn (Oanfoljende tabel S2). De yntensiteit fan wite skimmelynfeksje waard doe omset nei persintaazje mei formule 2:
Derneist waard it gebiet ûnder de sykteprogresjekurve (AUDPC) berekkene mei de formule (Shaner en Finney, 1977), dy't koartlyn oanpast is foar wite rot fan gewoane beanen (Chauhan et al., 2020) mei help fan fergeliking 3:
Wêrby't Yi = sykte-earnst op tiid ti, Yi+1 = sykte-earnst op it folgjende tiidstip ti+1, ti = tiid fan earste mjitting (yn dagen), ti+1 = tiid fan folgjende mjitting (yn dagen), n = totaal oantal tiidpunten of observaasjepunten. Groeiparameters fan beanplanten, ynklusyf planthichte (cm), oantal tûken per plant en oantal blêden per plant, waarden wykliks registrearre foar 21 dagen yn alle biologyske replikaten.
Yn elke biologyske replikaat waarden blêdmonsters (twadde en tredde folslein ûntwikkele blêden fan boppen) sammele op dei 45 nei behanneling (15 dagen nei de lêste behanneling). Elke biologyske replikaat bestie út fiif potten (twa planten per pot). Sawat 500 mg fan it ferpletterde weefsel waard brûkt foar de ekstraksje fan fotosyntetyske pigmenten (chlorofyl a, chlorofyl b en karotenoïden) mei 80% aceton by 4 °C yn it tsjuster. Nei 24 oeren waarden de monsters sintrifugearre en waard de supernatant sammele foar de bepaling fan chlorofyl a, chlorofyl b en karotenoïde-ynhâld kolorimetrysk mei in UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) neffens de metoade fan (Lichtenthaler, 1987) troch it mjitten fan de absorbânsje by trije ferskillende golflingten (A470, A646 en A663 nm). Uteinlik waard de ynhâld fan fotosyntetyske pigmenten berekkene mei de folgjende formules 4-6 beskreaun troch Lichtenthaler (1987).
72 oeren nei behanneling (hpt) waarden blêden (twadde en tredde folslein ûntwikkele blêden fan 'e boppekant) sammele fan elke biologyske replikaat foar in situ histochemyske lokalisaasje fan wetterstofperokside (H2O2) en superokside-anion (O2•−). Elke biologyske replikaat bestie út fiif potten (twa planten per pot). Elke biologyske replikaat waard yn duplikaat analysearre (twa technyske replikaten) om de krektens, betrouberens en reprodusearberens fan 'e metoade te garandearjen. H2O2 en O2•− waarden bepaald mei 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Dútslân) of nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Dútslân), neffens de metoaden beskreaun troch Romero-Puertas et al. (2004) en Adam et al. (1989) mei lytse oanpassingen. Foar histochemyske lokalisaasje fan H2O2 in situ waarden de blêden fakuüm ynfiltrearre mei 0.1% DAB yn 10 mM Tris-buffer (pH 7.8) en doe 60 minuten by keamertemperatuer yn it ljocht ynkubearre. De blêden waarden bleekt yn 0.15% (v/v) TCA yn 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaïro, Egypte) en doe bleatsteld oan ljocht oant se tsjuster waarden. Op deselde wize waarden kleppen fakuüm ynfiltrearre mei 10 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7.8) mei 0.1 w/v% HBT foar histochemyske lokalisaasje fan O2•− in situ. De blêden waarden 20 minuten by keamertemperatuer ynkubearre yn it ljocht, doe bleekt lykas hjirboppe, en doe ferljochte oant donkerblauwe/fiolette plakken ferskynden. De yntensiteit fan 'e resultearjende brune (as in H2O2-yndikator) of blau-fiolette (as in O2•−-yndikator) kleur waard beoardiele mei de Fiji-ferzje fan it ôfbyldingsferwurkingspakket ImageJ (http://fiji.sc; tagong 7 maart 2024).
Malondialdehyde (MDA; as in marker fan lipideperoksidaasje) waard bepaald neffens de metoade fan Du en Bramlage (1992) mei lytse oanpassingen. Blêden fan elke biologyske replikaat (twadde en tredde folslein ûntwikkele blêden fan 'e boppekant) waarden 72 oeren nei behanneling (hpt) sammele. Elke biologyske replikaat omfette fiif potten (twa planten per pot). Elke biologyske replikaat waard yn duplikaat analysearre (twa technyske replikaten) om de krektens, betrouberens en reprodusearberens fan 'e metoade te garandearjen. Koartsein, 0,5 g gemalen blêdweefsel waard brûkt foar MDA-ekstraksje mei 20% trichloorazijnzuur (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, FS) mei 0,01% butylearre hydroksytolueen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, FS). It MDA-gehalte yn it supernatant waard doe kolorimetrysk bepaald troch de absorbânsje te mjitten by 532 en 600 nm mei in UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) en doe útdrukt as nmol g−1 FW.
Foar de beoardieling fan net-enzymatyske en enzymatyske antioksidanten waarden blêden (twadde en tredde folslein ûntwikkele blêden fan 'e boppekant) sammele fan elke biologyske replikaat 72 oeren nei de behanneling (hpt). Elke biologyske replikaat bestie út fiif potten (twa planten per pot). Elk biologysk stekproef waard yn duplikaat analysearre (twa technyske stekproeven). Twa blêden waarden fermalen mei floeibere stikstof en direkt brûkt foar de bepaling fan enzymatyske en net-enzymatyske antioksidanten, totale aminosoeren, proline-ynhâld, genekspresje en oksalaatkwantifikaasje.
Totale oplosbere fenolen waarden bepaald mei it Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Feriene Steaten) mei lytse oanpassingen fan 'e metoade beskreaun troch Kahkonen et al. (1999). Koartsein, sawat 0,1 g homogenisearre blêdweefsel waard ekstrahearre mei 20 ml 80% methanol yn it tsjuster foar 24 oeren en de supernatant waard sammele nei sintrifugaasje. 0,1 ml fan it stekproefekstrakt waard mingd mei 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10%), skodde foar 30 sekonden en litten yn it tsjuster foar 5 minuten. Dêrnei waard 0,5 ml fan 20% natriumkarbonaatoplossing (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egypte) tafoege oan elke buis, goed mingd en ynkubearre by keamertemperatuer yn it tsjuster foar 1 oere. Nei ynkubaasje waard de absorbânsje fan it reaksjemingsel metten by 765 nm mei in UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De konsintraasje fan totale oplosbere fenolen yn 'e stekproefekstrakten waard bepaald mei in gallussoerkalibraasjekromme (Fisher Scientific, Hampton, NH, Feriene Steaten) en útdrukt as milligram gallussoerekwivalent per gram farsk gewicht (mg GAE g-1 farsk gewicht).
De totale oplosbere flavonoïde-ynhâld waard bepaald neffens de metoade fan Djeridane et al. (2006) mei lytse oanpassingen. Koartsein, 0,3 ml fan it boppesteande metanolekstrakt waard mingd mei 0,3 ml fan in 5% aluminiumchloride-oplossing (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, Feriene Steaten), krêftich roerd en doe 5 minuten by keamertemperatuer ynkubearre, folge troch de tafoeging fan 0,3 ml fan in 10% kaliumacetaat-oplossing (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaïro, Egypte), goed mingd en 30 minuten by keamertemperatuer ynkubearre yn it tsjuster. Nei ynkubaasje waard de absorbânsje fan it reaksjemingsel metten by 430 nm mei in UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De konsintraasje fan totale oplosbere flavonoïden yn stekproefekstrakten waard bepaald mei in rutine-kalibraasjekromme (TCI America, Portland, OR, Feriene Steaten) en doe útdrukt as milligram rutine-ekwivalint per gram farsk gewicht (mg RE g-1 farsk gewicht).
It totale frije aminosoergehalte fan beanblêden waard bepaald mei in modifisearre ninhydrine-reagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Feriene Steaten) basearre op 'e metoade foarsteld troch Yokoyama en Hiramatsu (2003) en oanpast troch Sun et al. (2006). Koartsein, 0,1 g gemalen weefsel waard ekstrahearre mei pH 5,4 buffer, en 200 μL fan 'e supernatant waard reagearre mei 200 μL ninhydrine (2%) en 200 μL pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, Feriene Steaten), ynkubearre yn in siedend wetterbad foar 30 minuten, doe ôfkuolle en metten by 580 nm mei in UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Oan 'e oare kant waard proline bepaald mei de Bates-metoade (Bates et al., 1973). Proline waard ekstrahearre mei 3% sulfosalicylsoer (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Feriene Steaten) en nei sintrifugaasje waard 0,5 ml fan 'e supernatant mingd mei 1 ml iisazijn (Fisher Scientific, Hampton, NH, Feriene Steaten) en ninhydrinereagens, ynkubearre by 90 °C foar 45 minuten, ôfkuolle en metten by 520 nm mei deselde spektrofotometer as hjirboppe. Totaal frije aminosoeren en proline yn 'e blêdekstrakten waarden bepaald mei help fan glycine- en prolinekalibraasjekurven (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Feriene Steaten), respektivelik, en útdrukt as mg/g farsk gewicht.
Om de enzymatyske aktiviteit fan antioksidant-enzymen te bepalen, waard sawat 500 mg homogenisearre weefsel ekstrahearre mei 3 ml fan 50 mM Tris-buffer (pH 7.8) mei 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Feriene Steaten) en 7.5% polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Feriene Steaten), sintrifugearre by 10.000 × g foar 20 minuten ûnder kuolling (4 °C), en de supernatant (rûch enzyme-ekstrakt) waard sammele (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) waard doe reagearre mei 2 ml fan 0.1 M natriumfosfaatbuffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Feriene Steaten) en 100 μl fan 269 mM H2O2-oplossing om syn enzymatyske aktiviteit te bepalen neffens de metoade fan Aebi (1984) mei lytse oanpassingen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiacol-ôfhinklike peroxidase (POX) enzymatyske aktiviteit waard bepaald mei de metoade fan Harrach et al. (2009). (2008) mei lytse oanpassingen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) en de enzymatyske aktiviteit fan polyfenoloksidase (PPO) waard bepaald nei reaksje mei 2,2 ml fan 100 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6,0), 100 μl fan guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, Feriene Steaten) en 100 μl fan 12 mM H2O2. De metoade waard wat oanpast fan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). De assay waard útfierd nei reaksje mei 3 ml fan in katecholoplossing (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Feriene Steaten) (0,01 M) dy't farsk taret wie yn 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,0). CAT-aktiviteit waard metten troch de ûntbining fan H2O2 te kontrolearjen by 240 nm (A240), POX-aktiviteit waard metten troch de tanimming fan absorbânsje te kontrolearjen by 436 nm (A436), en PPO-aktiviteit waard metten troch absorbânsjefluktuaasjes by 495 nm (A495) elke 30 sekonden foar 3 minuten te registrearjen mei in UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu, Japan).
Real-time RT-PCR waard brûkt om de transkriptnivo's fan trije antioxidant-relatearre genen te detektearjen, ynklusyf peroksisomale katalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), en glutathionreduktase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), yn beanblêden (de twadde en tredde folslein ûntwikkele blêden fan 'e boppekant) 72 oeren nei de lêste behanneling. Koartsein, RNA waard isolearre mei de Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Sina) neffens it protokol fan 'e fabrikant. Dêrnei waard cDNA synthetisearre mei de TOP script™ cDNA Synthesis Kit neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. De primersekwinsjes fan 'e boppesteande trije genen binne neamd yn Oanfoljende Tabel S3. PvActin-3 (GenBank-tagongsnûmer: XM_068616709.1) waard brûkt as it húshâldingsgen en de relative genekspresje waard berekkene mei de 2-ΔΔCT-metoade (Livak en Schmittgen, 2001). Aktine-stabiliteit ûnder biotyske stress (ynkompatibele ynteraksje tusken gewoane peulvruchten en de antraknose-skimmel Colletotrichum lindemuthianum) en abiotyske stress (droechte, sâltgehalte, lege temperatuer) waard oantoand (Borges et al., 2012).
Wy hawwe yn earste ynstânsje in genoomwide in silico-analyze útfierd fan oksaloasetaat-acetylhydrolase (OAH)-proteinen yn S. sclerotiorum mei de protein-protein BLAST-tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Koartsein, wy brûkten OAH fan Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; takside: 1191702; GenBank-tagongsnûmer XP_040799428.1; 342 aminosoeren) en Penicillium lagena (PlOAH; takside: 94218; GenBank-tagongsnûmer XP_056833920.1; 316 aminosoeren) as querysekwinsjes om it homologe protein yn S. sclerotiorum (takside: 5180) yn kaart te bringen. BLASTp waard útfierd tsjin de meast resint beskikbere S. sclerotiorum genoomgegevens yn GenBank op 'e webside fan it National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Derneist waarden it foarseine OAH-gen fan S. sclerotiorum (SsOAH) en de evolúsjonêre analyze en fylogenetyske beam fan AfOAH fan A. fijiensis CBS 313.89 en PlOAH fan P. lagena ôflaat mei de maximum likelihood-metoade yn MEGA11 (Tamura et al., 2021) en it JTT-matrix-basearre model (Jones et al., 1992). De fylogenetyske beam waard kombinearre mei de meardere alignment-analyze fan proteïnesekwinsjes fan alle foarseine OAH-genen (SsOAH) fan S. sclerotiorum en de query-sekwinsje mei de Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos en Agarwala, 2007). Derneist waarden de bêst oerienkommende aminosoersekwinsjes fan SsOAH út S. sclerotiorum ôfstimd mei de querysekwinsjes (AfOAH en PlOAH) (Larkin et al., 2007) mei help fan ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), en waarden konservearre regio's yn 'e ôfstimming visualisearre mei de ESPript-ark (ferzje 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Fierder waarden de foarseine funksjonele represintative domeinen en konservearre plakken fan S. sclerotiorum SsOAH ynteraktyf yndield yn ferskate famyljes mei de InterPro-tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Uteinlik waard trijediminsjonale (3D) struktuermodellering fan 'e foarseine S. sclerotiorum SsOAH útfierd mei de Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-tsjinner ferzje 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) en validearre mei de SWISS-MODEL-tsjinner (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De foarseine trijediminsjonale struktueren (PDB-formaat) waarden ynteraktyf fisualisearre mei it UCSF-Chimera-pakket (ferzje 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kwantitative real-time fluoreszinsje-PCR waard brûkt om it transkripsjonele nivo fan oksaloasetaat-acetylhydrolase (SsOAH; GenBank-tagongsnûmer: XM_001590428.1) yn 'e mycelia fan Sclerotinia sclerotiorum te bepalen. Koartsein, S. sclerotiorum waard yn in fleske mei PDB ynintingd en pleatst yn in skodzjende ynkubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, FS) by 25 ± 2 °C foar 24 oeren by 150 rpm en yn konstante tsjuster (24 oeren) om myceliumgroei te stimulearjen. Dêrnei waarden de sellen behannele mei L-ornithine en it fungicide Rizolex-T by definitive IC50-konsintraasjes (respektyflik sawat 40 en 3,2 mg/L) en doe nochris 24 oeren ûnder deselde omstannichheden kultivearre. Nei ynkubaasje waarden de kultueren 5 minuten sintrifugearre by 2500 rpm en waard it supernatant (skimmelmycelium) sammele foar genekspresje-analyze. Op deselde wize waard skimmelmycelium sammele op 0, 24, 48, 72, 96 en 120 oeren nei ynfeksje fan ynfekteare planten dy't wite skimmel en wattich mycelium foarme hiene op it oerflak fan ynfekteare weefsels. RNA waard ekstrahearre út it skimmelmycelium en doe waard cDNA synthetisearre lykas hjirboppe beskreaun. De primersekwinsjes foar SsOAH binne neamd yn Oanfoljende Tabel S3. SsActin (GenBank-tagongsnûmer: XM_001589919.1) waard brûkt as it húshâldingsgen, en relative genekspresje waard berekkene mei de 2-ΔΔCT-metoade (Livak en Schmittgen, 2001).
Oksaalsoer waard bepaald yn ierappeldextrosebouillon (PDB) en plantmonsters mei de skimmelpatogeen Sclerotinia sclerotiorum neffens de metoade fan Xu en Zhang (2000) mei lytse oanpassingen. Koartsein waarden S. sclerotiorum-isolaten ynintingd yn kolven mei PDB en doe kultivearre yn in skodde-ynkubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, FS) by 150 rpm by 25 ± 2 °C foar 3-5 dagen yn konstante tsjuster (24 oeren) om myceliumgroei te stimulearjen. Nei ynkubaasje waard de skimmelkultuer earst filtere troch Whatman #1 filterpapier en doe sintrifugearre by 2500 rpm foar 5 minuten om oerbleaune mycelium te ferwiderjen. De supernatant waard sammele en opslein by 4 °C foar fierdere kwantitative bepaling fan oksalaat. Foar de tarieding fan plantmonsters waarden sawat 0,1 g plantweefselfragminen trije kear ekstrahearre mei destillearre wetter (2 ml elke kear). De samples waarden doe 5 minuten sintrifugearre by 2500 rpm, it supernatant waard droech filtere troch Whatman nr. 1 filterpapier en sammele foar fierdere analyze.
Foar kwantitative analyze fan oksaalsoer waard it reaksjemingsel taret yn in buis mei in glêzen stop yn 'e folgjende folchoarder: 0,2 ml fan it stekproef (of PDB-kultuerfiltraat of oksaalsoerstandertoplossing), 0,11 ml bromofenolblau (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, Feriene Steaten), 0,198 ml fan 1 M swevelsoer (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypte) en 0,176 ml fan 100 mM kaliumdichromaat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, Feriene Steaten), en doe waard de oplossing ferdund ta 4,8 ml mei destillearre wetter, krêftich mingd en fuortendaliks yn in wetterbad fan 60 °C pleatst. Nei 10 minuten waard de reaksje stoppe troch it tafoegjen fan 0,5 ml natriumhydrokside-oplossing (NaOH; 0,75 M). De absorbânsje (A600) fan it reaksjemingsel waard metten by 600 nm mei in UV-160 spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB en destillearre wetter waarden brûkt as kontrôles foar de kwantifikaasje fan kultuerfiltraten en plantmonsters, respektivelik. De oksaalsoerkonsintraasjes yn 'e kultuerfiltraten, útdrukt as mikrogrammen oksaalsoer per milliliter PDB-medium (μg.mL−1), en yn 'e blêdekstrakten, útdrukt as mikrogrammen oksaalsoer per gram farsk gewicht (μg.g−1 FW), waarden bepaald mei in oksaalsoerkalibraasjekromme (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Feriene Steaten).
Yn 'e rin fan' e stúdzje waarden alle eksperiminten ûntworpen yn in folslein randomisearre ûntwerp (CRD) mei seis biologyske replikaten per behanneling en fiif potten per biologyske replikaat (twa planten per pot), útsein as oars oanjûn. Biologyske replikaten waarden yn duplikaat analysearre (twa technyske replikaten). Technyske replikaten waarden brûkt om de reprodusearberens fan itselde eksperimint te kontrolearjen, mar waarden net brûkt yn 'e statistyske analyze om falske replikaten te foarkommen. Gegevens waarden statistysk analysearre mei fariânsjeanalyse (ANOVA) folge troch de Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD) test (p ≤ 0.05). Foar in vitro-eksperiminten waarden IC50- en IC99-wearden berekkene mei it probitmodel en waarden 95% fertrouwensyntervallen berekkene.
In totaal fan fjouwer isolaten waarden sammele út ferskate sojabonefjilden yn it El Ghabiya Governorate, Egypte. Op PDA-medium produsearren alle isolaten romich wyt mycelium dat fluch katoenwyt waard (Ofbylding 1A) en doe beige of brún yn it sklerotiumstadium. Sklerotia binne meastentiids ticht, swart, sferysk of unregelmjittich fan foarm, 5,2 oant 7,7 mm lang en 3,4 oant 5,3 mm yn diameter (Ofbylding 1B). Hoewol fjouwer isolaten in marginaal patroan fan sklerotia oan 'e râne fan it kweekmedium ûntwikkelen nei 10-12 dagen ynkubaasje by 25 ± 2 °C (Ofbylding 1A), wie it oantal sklerotia per plaat signifikant oars tusken har (P < 0,001), wêrby't isolaat 3 it heechste oantal sklerotia hie (32,33 ± 1,53 sklerotia per plaat; Ofbylding 1C). Op deselde wize produsearre isolaat #3 mear oksaalsoer yn PDB as oare isolaten (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolaat #3 liet typyske morfologyske en mikroskopyske skaaimerken sjen fan 'e fytopathogene skimmel Sclerotinia sclerotiorum. Bygelyks, op PDA groeiden koloanjes fan isolaat #3 rap, wiene romich wyt (Figuer 1A), omkearde beige of ljocht salmgielbrún, en hiene 6-7 dagen nedich by 25 ± 2°C om it oerflak fan in plaat mei in diameter fan 9 sm folslein te dekken. Op basis fan 'e boppesteande morfologyske en mikroskopyske skaaimerken waard isolaat #3 identifisearre as Sclerotinia sclerotiorum.
Figuer 1. Karakteristiken en patogeniteit fan S. sclerotiorum-isolaten fan gewoane peulvruchten. (A) Myceliumgroei fan fjouwer S. sclerotiorum-isolaten op PDA-medium, (B) sklerotie fan fjouwer S. sclerotiorum-isolaten, (C) oantal sklerotie (per plaat), (D) oksaalsoersekresje op PDB-medium (μg.mL−1), en (E) sykte-earnst (%) fan fjouwer S. sclerotiorum-isolaten op gefoelige kommersjele peulvruchtkultivar Giza 3 ûnder broeikasomstannichheden. Wearden fertsjintwurdigje it gemiddelde ± SD fan fiif biologyske replikaten (n = 5). Ferskillende letters jouwe statistysk signifikante ferskillen oan tusken behannelingen (p < 0,05). (F–H) Typyske wite skimmelsymptomen ferskynden op boppegrûnske stielen en siliken, respektivelik, 10 dagen nei yninting mei isolaat #3 (dpi). (I) Evolúsjonêre analyze fan 'e ynterne transkribearre spacer (ITS) regio fan S. sclerotiorum isolaat #3 waard útfierd mei de maksimale likelihood-metoade en fergelike mei 20 referinsje-isolaten/stammen dy't krigen binne út 'e database fan it National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). De sifers boppe de klusterlinen jouwe de regiodekking oan (%), en de sifers ûnder de klusterlinen jouwe de tûkelingte oan.
Fierder, om de patogeniteit te befêstigjen, waarden fjouwer krigen S. sclerotiorum-isolaten brûkt om de gefoelige kommersjele beankultivar Giza 3 ûnder broeikasomstannichheden te ynokulearjen, wat oerienkomt mei de postulaten fan Koch (Fig. 1E). Hoewol alle krigen skimmelisolaten pathogeen wiene en de griene bean (cv. Giza 3) ynfektearje koene, wêrtroch typyske wite skimmelsymptomen op alle boppegrûnske dielen feroarsake waarden (Fig. 1F), benammen op 'e stielen (Fig. 1G) en peulen (Fig. 1H) op 10 dagen nei ynokulaasje (dpi), wie isolaat 3 it meast agressive isolaat yn twa ûnôfhinklike eksperiminten. Isolaat 3 hie de heechste sykte-earnst (%) op beanplanten (respektyflik 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, en 76,7 ± 3,1 op 7, 14, en 21 dagen nei ynfeksje; Figuer 1F).
De identifikaasje fan it meast invasive S. sclerotiorum-isolaat #3 waard fierder befêstige op basis fan ynterne transkribearre spacer (ITS) sekwinsje (Fig. 1I). Fylogenetyske analyze tusken isolaat #3 en 20 referinsje-isolaten/stammen liet in hege oerienkomst (>99%) sjen tusken har. It is it neamen wurdich dat it S. sclerotiorum-isolaat #3 (533 bp) in hege oerienkomst hat mei it Amerikaanske S. sclerotiorum-isolaat LPM36 isolearre út droege eartesieden (GenBank-tagongsnûmer MK896659.1; 540 bp) en it Sineeske S. sclerotiorum-isolaat YKY211 (GenBank-tagongsnûmer OR206374.1; 548 bp), dat fioele (Matthiola incana) stamrot feroarsaket, dy't allegear apart groepearre binne oan 'e boppekant fan it dendrogram (Figuer 1I). De nije sekwinsje is opslein yn 'e NCBI-database en hat de namme "Sclerotinia sclerotiorum - isolaat YN-25" krigen (GenBank-tagongsnûmer PV202792). It is te sjen dat isolaat 3 it meast invasive isolaat is; dêrom waard dit isolaat keazen foar stúdzje yn alle folgjende eksperiminten.
De antibakteriële aktiviteit fan it diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Dútslân) by ferskate konsintraasjes (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) tsjin S. sclerotiorum isolaat 3 waard yn vitro ûndersocht. It is opmerklik dat L-ornithine in antibakteriële effekt útoefene en stadichoan de radiale groei fan S. sclerotiorum hyfen op in dosisôfhinklike manier remde (Ofbylding 2A, B). By de heechste testte konsintraasje (125 mg/L) liet L-ornithine de heechste myceliumgroei-remmingssnelheid sjen (99,62 ± 0,27%; Ofbylding 2B), wat lykweardich wie oan it kommersjele fungicide Rizolex-T (remmingssnelheid 99,45 ± 0,39%; Ofbylding 2C) by de heechste testte konsintraasje (10 mg/L), wat in ferlykbere effektiviteit oanjout.
Figuer 2. In vitro antibakteriële aktiviteit fan L-ornithine tsjin Sclerotinia sclerotiorum. (A) Ferliking fan 'e antibakteriële aktiviteit fan ferskate konsintraasjes fan L-ornithine tsjin S. sclerotiorum mei it kommersjele fungicide Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Ynhibysjetaryf (%) fan S. sclerotiorum myceliumgroei nei behanneling mei ferskate konsintraasjes fan L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) of Rizolex-T (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L), respektivelik. Wearden fertsjintwurdigje it gemiddelde ± SD fan fiif biologyske replikaten (n = 5). Ferskillende letters jouwe statistyske ferskillen oan tusken behannelingen (p < 0,05). (D, E) Probitmodelregresje-analyze fan L-ornithine en kommersjele fungicide Rizolex-T, respektivelik. De regresjeline fan it probitmodel wurdt werjûn as in fêste blauwe line, en it fertrouwensynterval (95%) wurdt werjûn as in stippele reade line.
Derneist waard probit-regresje-analyze útfierd en de oerienkommende plots wurde werjûn yn tabel 1 en figueren 2D, E. Koartsein, de akseptabele hellingwearde (y = 2,92x − 4,67) en byhearrende wichtige statistiken (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 en p < 0,0001; figuer 2D) fan L-ornithine joegen in ferhege antifungale aktiviteit oan tsjin S. sclerotiorum yn ferliking mei it kommersjele fungicide Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 en p < 0,0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Wearden fan heal-maksimale remmende konsintraasje (IC50) en IC99 (mg/l) fan L-ornithine en kommersjele fungicide "Rizolex-T" tsjin S. sclerotiorum.
Oer it algemien fermindere L-ornithine (250 mg/L) de ûntwikkeling en earnst fan wite skimmel op behannele gewoane beanplanten signifikant yn ferliking mei net-behannele S. sclerotiorum-ynfekteare planten (kontrôle; Figuer 3A). Koartsein, hoewol de earnst fan 'e sykte fan net-behannele ynfekteare kontrôleplanten stadichoan tanommen (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, en 92,33 ± 3,06%), fermindere L-ornithine de earnst fan 'e sykte (%) signifikant yn 'e heule eksperimint (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, en 26,36 ± 3,07) op 7, 14, en 21 dagen nei behanneling (dpt), respektivelik (Figuer 3A). Op deselde wize, doe't S. sclerotiorum-ynfekteare beanplanten behannele waarden mei 250 mg/L L-ornithine, naam it gebiet ûnder de sykteprogresjekurve (AUDPC) ôf fan 1274,33 ± 33,13 yn 'e net-behannele kontrôle nei 281,03 ± 7,95, wat wat leger wie as dat fan 'e positive kontrôle 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Deselde trend waard waarnommen yn it twadde eksperimint.
Fig. 3. Effekt fan eksogene tapassing fan L-ornithine op 'e ûntwikkeling fan wite rot fan gewoane bean feroarsake troch Sclerotinia sclerotiorum ûnder broeikasomstannichheden. (A) Sykteprogresjekurve fan wite skimmel fan gewoane bean nei behanneling mei 250 mg/L L-ornithine. (B) Gebiet ûnder de sykteprogresjekurve (AUDPC) fan wite skimmel fan gewoane bean nei behanneling mei L-ornithine. Wearden fertsjintwurdigje it gemiddelde ± SD fan fiif biologyske replikaten (n = 5). Ferskillende letters jouwe statistysk signifikante ferskillen tusken behannelingen oan (p < 0,05).
Eksogene tapassing fan 250 mg/L L-ornithine fergrutte stadichoan de planthichte (Fig. 4A), it oantal tûken per plant (Fig. 4B) en it oantal blêden per plant (Fig. 4C) nei 42 dagen. Wylst it kommersjele fungicide Rizolex-T (50 mg/L) it grutste effekt hie op alle bestudearre fiedingsparameters, hie eksogene tapassing fan 250 mg/L L-ornithine it twadde grutste effekt yn ferliking mei net-behannele kontrôles (Figs. 4A-C). Oan 'e oare kant hie de behanneling mei L-ornithine gjin signifikant effekt op it gehalte oan fotosyntetyske pigmenten chlorofyl a (Fig. 4D) en chlorofyl b (Fig. 4E), mar ferhege it totale karotenoïdegehalte wat (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) yn ferliking mei de negative kontrôle (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) en positive kontrôle (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Oer it algemien jouwe dizze resultaten oan dat L-ornithine net fytotoksisk is foar behannele peulvruchten en sels har groei kin stimulearje.
Fig. 4. Effekt fan eksogene L-ornithine-tapassing op groeieigenskippen en fotosyntetyske pigmenten fan beaneblêden ynfekteare mei Sclerotinia sclerotiorum ûnder broeikasomstannichheden. (A) Planthichte (cm), (B) Oantal tûken per plant, (C) Oantal blêden per plant, (D) Chlorofyl a-ynhâld (mg g-1 fr wt), (E) Chlorofyl b-ynhâld (mg g-1 fr wt), (F) Totaal karotenoïde-ynhâld (mg g-1 fr wt). Wearden binne it gemiddelde ± SD fan fiif biologyske replikaten (n = 5). Ferskillende letters jouwe statistysk signifikante ferskillen oan tusken behannelingen (p < 0,05).
In situ histochemyske lokalisaasje fan reaktive soerstofsoarten (ROS; útdrukt as wetterstofperokside [H2O2]) en frije radikalen (útdrukt as superokside-anionen [O2•−]) liet sjen dat eksogene tapassing fan L-ornithine (250 mg/L) de opgarjen fan H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) en O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) signifikant fermindere yn ferliking mei de opgarjen fan sawol net-behannele ynfekteare planten (respektyflik 173,31 ± 12,06 en 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) as planten behannele mei 50 mg/L fan it kommersjele fungicide Rizolex-T (respektyflik 170,12 ± 9,50 en 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) nei 72 oeren. Hege nivo's fan H2O2 en O2•− sammelen har op ûnder hpt (Fig. 5A, B). Op deselde wize liet in TCA-basearre malondialdehyde (MDA)-assay sjen dat mei S. sclerotiorum ynfekteare beanplanten hegere nivo's fan MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) yn har blêden sammelen (Fig. 5C). Eksogene tapassing fan L-ornithine fermindere lykwols signifikant de lipideperoksidaasje, lykas bliken docht út de ôfname fan MDA-ynhâld yn behannele planten (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effekt fan eksogene L-ornithine-tapassing op wichtige markers fan oksidative stress en net-enzymatyske antioxidant-ferdigeningsmeganismen yn beanblêden ynfekteare mei S. sclerotiorum 72 oeren nei ynfeksje ûnder broeikasomstannichheden. (A) Wetterstofperokside (H2O2; nmol g−1 FW) by 72 hpt, (B) superoxide-anion (O2•−; nmol g−1 FW) by 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) by 72 hpt, (D) totale oplosbere fenolen (mg GAE g−1 FW) by 72 hpt, (E) totale oplosbere flavonoïden (mg RE g−1 FW) by 72 hpt, (F) totale frije aminosoeren (mg g−1 FW) by 72 hpt, en (G) proline-ynhâld (mg g−1 FW) by 72 hpt. Wearden fertsjintwurdigje it gemiddelde ± standertôfwiking (gemiddelde ± SD) fan 5 biologyske replikaten (n = 5). Ferskillende letters jouwe statistysk signifikante ferskillen tusken behannelingen oan (p < 0,05).