Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy jo in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Insuline-nanopartikels (NP's) mei in hege ladingsynhâld hawwe ferskate tapassingen fûn yn ferskate doseringsfoarmen. Dit wurk hat as doel it effekt fan friezedroeging en spuitdroeging te evaluearjen op 'e struktuer fan insuline-laden chitosan-nanopartikels, mei of sûnder mannitol as kryoprotectant. Wy hawwe ek de kwaliteit fan dizze nanopartikels beoardiele troch se opnij op te lossen. Foar dehydrataasje waard de dieltsjegrutte fan 'e chitosan/natriumtripolyfosfaat/insuline-ferbûne nanopartikels optimalisearre ta 318 nm, de PDI wie 0,18, de ynkapselingseffisjinsje wie 99,4%, en de lading wie 25,01%. Nei rekonstitúsje behâlden alle nanopartikels, útsein dyjingen produsearre troch in friezedroegingmetoade sûnder gebrûk fan mannitol, har sferyske dieltsjestruktuer. Yn ferliking mei mannitol-befette nanopartikels dy't dehydratearre waarden troch spray, lieten mannitolfrije spuitdroege nanopartikels ek de lytste gemiddelde dieltsjegrutte (376 nm) en de heechste ladingsynhâld sjen. (25,02%) mei in ferlykbere ynkapselingsrate (98,7%) en PDI (0,20) troch droech- of friezedroegtechniken. De droege nanopartikels troch sproeidroeging sûnder mannitol resultearren ek yn 'e rapste frijlitting fan insuline en de heechste effisjinsje fan sellulêre opname. Dit wurk lit sjen dat sproeidroeging insuline-nanopartikels kin útdroegje sûnder de needsaak foar kryoprotectanten yn ferliking mei konvinsjonele friezedroegmetoaden, wêrtroch't in gruttere laadkapasiteit, legere tafoegingseasken en in wichtige foardiel foar eksploitaasjekosten ûntstiet.
Sûnt syn ûntdekking yn 19221,2,3 hawwe insuline en syn farmaseutyske tariedingen it libben rêden fan pasjinten mei type 1-diabetes (T1DM) en type 2-diabetes (T1DM). Fanwegen syn eigenskippen as in proteïne mei in heech molekulêr gewicht wurdt insuline lykwols maklik aggregearre, ôfbrutsen troch proteolytyske enzymen en eliminearre troch it earste-pass-effekt. Minsken dy't diagnostisearre binne mei type 1-diabetes hawwe de rest fan har libben insuline-ynjeksjes nedich. In protte pasjinten dy't yn earste ynstânsje diagnostisearre binne mei type 2-diabetes hawwe ek langduorjende insuline-ynjeksjes nedich. Deistige insuline-ynjeksjes binne in serieuze boarne fan deistige pine en ûngemak foar dizze persoanen, mei negative effekten op 'e geastlike sûnens. As gefolch wurde oare foarmen fan insuline-administraasje dy't minder ûngemak feroarsaakje, lykas orale insuline-administraasje, wiidweidich bestudearre5, om't se de potinsje hawwe om de kwaliteit fan libben fan sawat 5 miljard minsken mei diabetes wrâldwiid te herstellen.
Nanopartikeltechnology hat in wichtige foarútgong brocht yn besykjen om orale insuline yn te nimmen4,6,7. Ien dy't insuline effektyf ynkapselet en beskermet tsjin degradaasje foar rjochte levering oan spesifike lichemsplakken. It gebrûk fan nanopartikelformuleringen hat lykwols ferskate beheiningen, benammen fanwegen stabiliteitsproblemen fan dieltsjessuspensjes. Guon aggregaasje kin foarkomme tidens opslach, wat de biobeskikberens fan insuline-laden nanopartikels8 ferminderet. Derneist moat de gemyske stabiliteit fan 'e polymeermatrix fan nanopartikels en insuline ek wurde beskôge om de stabiliteit fan insulin-nanopartikels (NP's) te garandearjen. Op it stuit is friezedroegingtechnology de gouden standert foar it meitsjen fan stabile NP's, wylst net winske feroaringen tidens opslach9 foarkommen wurde.
Friezedrûgjen fereasket lykwols de tafoeging fan kryoprotectanten om te foarkommen dat de sferyske struktuer fan NP's beynfloede wurdt troch de meganyske stress fan iiskristallen. Dit ferminderet de lading fan insulin-nanopartikels signifikant nei lyofilisaasje, om't it kryoprotectant it measte fan 'e gewichtsferhâlding ynnimt. Dêrom wurde de produsearre insulin-NP's faak net geskikt fûn foar de fabrikaazje fan droege poeierformuleringen, lykas orale tabletten en orale films, fanwegen de needsaak foar grutte hoemannichten droege nanopartikels om it terapeutyske finster fan insuline te berikken.
Spraydrogen is in bekend en goedkeap proses op yndustriële skaal foar it produsearjen fan droege poeders út floeibere fazen yn 'e farmaseutyske yndustry10,11. Kontrôle oer it dieltsjefoarmingsproses makket juste ynkapseling fan ferskate bioaktive ferbiningen mooglik 12, 13. Fierder is it in effektive technyk wurden foar de tarieding fan ynkapsele proteïnen foar orale administraasje. Tidens spraydrogen ferdampt wetter tige fluch, wat helpt om de temperatuer fan 'e dieltsjekearn leech te hâlden11,14, wêrtroch't de tapassing mooglik is om waarmtegefoelige komponinten yn te kapseljen. Foar it spraydrogen moat it coatingmateriaal yngeand homogenisearre wurde mei de oplossing dy't de ynkapsele yngrediïnten befettet11,14. Oars as friezedrogen ferbetteret homogenisaasje foar ynkapseling by spraydrogen de ynkapselingseffisjinsje tidens dehydrataasje. Om't it spraydrogende ynkapselingsproses gjin kryoprotectanten fereasket, kin spraydrogen brûkt wurde om droege NP's te produsearjen mei in hege ladingynhâld.
Dizze stúdzje rapportearret de produksje fan insulin-laden NP's troch crosslinking fan chitosan en natriumtripolyfosfaat mei in iongelmetoade. Iongelaasje is in tariedingsmetoade dy't de produksje fan nanopartikels mooglik makket troch elektrostatyske ynteraksjes tusken twa of mear ionyske soarten ûnder bepaalde omstannichheden. Sawol friezedroeging- as spraydroegingtechniken waarden brûkt om de optimalisearre chitosan/natriumtripolyfosfaat/insuline crosslinked nanopartikels te dehydratearjen. Nei dehydrataasje waard har morfology analysearre troch SEM. Harren rekombinaasjefermogen waard evaluearre troch it mjitten fan har grutteferdieling, oerflaklading, PDI, ynkapselingseffisjinsje en laadynhâld. De kwaliteit fan opnij oplosbere nanopartikels produsearre troch ferskate dehydrataasjemetoaden waard ek evaluearre troch it fergelykjen fan har insulinbeskerming, frijlittingsgedrach en sellulêre opname-effektiviteit.
De pH fan 'e mingde oplossing en de ferhâlding fan chitosan en insuline binne twa wichtige faktoaren dy't ynfloed hawwe op 'e dieltsjegrutte en ynkapselingseffisjinsje (EE) fan 'e definitive NP's, om't se direkt ynfloed hawwe op it ionotropyske gelaasjeproses. De pH fan 'e mingde oplossing die bliken sterk korreleare te wêzen mei dieltsjegrutte en ynkapselingseffisjinsje (Fig. 1a). Lykas te sjen is yn Fig. 1a, doe't de pH tanommen fan 4.0 nei 6.0, naam de gemiddelde dieltsjegrutte (nm) ôf en naam de EE signifikant ta, wylst doe't de pH tanommen nei 6.5, de gemiddelde dieltsjegrutte begon te tanimmen en de EE net feroare bleau. Doe't de ferhâlding fan chitosan ta insuline tanommen, naam ek de gemiddelde dieltsjegrutte ta. Fierder waard gjin feroaring yn EE waarnommen doe't nanopartikels waarden taret mei in massaferhâlding fan chitosan/insuline heger as 2.5:1 (w/w) (Fig. 1b). Dêrom waarden de optimale tariedingsomstannichheden yn dizze stúdzje (pH 6.0, chitosan/insuline massaferhâlding fan 2.5:1) brûkt. om insuline-laden nanopartikels ta te rieden foar fierdere stúdzje. Under dizze tariedingsbetingsten waard de gemiddelde dieltsjegrutte fan insuline-nanopartikels optimalisearre ta 318 nm (Fig. 1c), de PDI wie 0,18, de ynbêdingseffisjinsje wie 99,4%, de zeta-potinsjaal wie 9,8 mv, en de insulinelading wie 25,01% (m/m). Op basis fan resultaten fan transmissie-elektronenmikroskopie (TEM) wiene de optimalisearre nanopartikels rûchwei sferysk en diskreet mei relatyf unifoarme grutte (Fig. 1d).
Parameteroptimalisaasje fan insulin-nanopartikels: (a) it effekt fan pH op 'e gemiddelde diameter en ynkapselingseffisjinsje (EE) fan insulin-nanopartikels (taret mei in massaferhâlding fan 5:1 fan chitosan en insulin); (b) chitosan en ynfloed fan 'e massaferhâlding fan insulin op 'e gemiddelde diameter en ynkapselingseffisjinsje (EE) fan insulin-NP's (taret by pH 6); (c) dieltsjegrutteferdieling fan optimalisearre insulin-nanopartikels; (d) TEM-mikrograaf fan optimalisearre insulin-NP's.
It is wol bekend dat chitosan in swakke polyelektrolyt is mei in pKa fan 6.5. It is posityf laden yn soere media, om't syn wichtichste aminogroep protonearre wurdt troch wetterstofionen15. Dêrom wurdt it faak brûkt as drager om negatyf laden makromolekulen yn te kapseljen. Yn dizze stúdzje waard chitosan brûkt om insuline yn te kapseljen mei in isoelektrysk punt fan 5.3. Om't chitosan brûkt wurdt as in coatingmateriaal, nimt de dikte fan 'e bûtenste laach fan' e nanopartikels oerienkommende ta mei de tanimming fan syn proporsje, wat resulteart yn in gruttere gemiddelde dieltsjegrutte. Derneist kinne hegere nivo's fan chitosan mear insuline ynkapselje. Yn ús gefal wie EE it heechst doe't de ferhâlding fan chitosan en insuline 2.5:1 berikte, en der wie gjin wichtige feroaring yn EE doe't de ferhâlding bleau tanimmen.
Neist de ferhâlding fan chitosan en insuline spile pH ek in krúsjale rol yn 'e tarieding fan NP's. Gan et al. 17 bestudearren it effekt fan pH op 'e dieltsjegrutte fan chitosan-nanopartikels. Se fûnen in trochgeande ôfname yn dieltsjegrutte oant de pH 6.0 berikte, en in wichtige tanimming fan dieltsjegrutte waard waarnommen by pH > 6.0, wat oerienkomt mei ús waarnimmings. Dit ferskynsel komt troch it feit dat mei tanimmende pH it insulinmolekule in negative oerflaklading krijt, wêrtroch elektrostatyske ynteraksjes mei it chitosan/natriumtripolyfosfaat (TPP)-kompleks befoardere wurde, wat resulteart yn in lytse dieltsjegrutte en hege EE. Doe't de pH lykwols oanpast waard nei 6.5, waarden de aminogroepen op chitosan deprotonearre, wat resultearre yn chitosanfolding. Sa resulteart in hege pH yn minder bleatstelling fan amino-ionen oan TPP en insuline, wat resulteart yn legere crosslinking, in gruttere definitive gemiddelde dieltsjegrutte en in legere EE.
Analyse fan 'e morfologyske eigenskippen fan frieze-droege en spuitdroege NP's kin liede ta de seleksje fan bettere dehydrataasje- en poeierfoarmingstechniken. De foarkarsmetoade moat medisynstabiliteit, unifoarme dieltsjefoarm, hege medisynbelesting en goede oplosberens yn 'e orizjinele oplossing leverje. Yn dizze stúdzje, om de twa techniken better te fergelykjen, waarden insuline-NP's mei of sûnder 1% mannitol brûkt tidens dehydrataasje. Mannitol wurdt brûkt as in bulkingmiddel of kryoprotectant yn ferskate droege poeierformuleringen foar frieze-droegjen en spuitdroegjen. Foar de lyofilisearre insuline-nanopartikels sûnder mannitol, lykas werjûn yn figuer 2a, waard in heul poreuze poeierstruktuer mei grutte, unregelmjittige en rûge oerflakken waarnommen ûnder scanning elektronenmikroskopie (SEM). Pear aparte dieltsjes waarden ûntdutsen yn it poeier nei dehydrataasje (fig. 2e). Dizze resultaten joegen oan dat de measte NP's waarden ûntbûn tidens frieze-droegjen sûnder kryoprotectant. Foar frieze-droege en spuitdroege insuline-nanopartikels mei 1% mannitol waarden sferyske nanopartikels mei glêde oerflakken waarnommen (fig. 2b, d, f, h). Insuline Nanopartikels dy't sûnder mannitol spuitdroege waarden, bleauwen sferysk, mar wiene rimpelich op it oerflak (Fig. 2c). Sferyske en rimpelige oerflakken wurde fierder besprutsen yn 'e hjirûnder neamde testen foar frijlittingsgedrach en sellulêre opname. Op basis fan it sichtbere uterlik fan 'e droege NP's joegen sawol spuitdroege NP's sûnder mannitol as NP's dy't friezedroege en spuitdroege mei mannitol wiene, fyn NP-poeders (Fig. 2f, g, h). Hoe grutter it oerflak tusken de dieltsjeoerflakken, hoe heger de oplosberens en dêrom hoe heger de frijlittingssnelheid.
Morfology fan ferskate dehydratisearre insulin NP's: (a) SEM-ôfbylding fan lyofilisearre insulin NP's sûnder mannitol; (b) SEM-ôfbylding fan lyofilisearre insulin NP's mei mannitol; (c) spray-droege insulin NP's sûnder mannitol SEM-ôfbylding fan; (d) SEM-ôfbylding fan insulin NP's spray-droege mei mannitol; (e) ôfbylding fan lyofilisearre insulin NP's poeier sûnder mannitol; (f) ôfbylding fan lyofilisearre insulin NP's mei mannitol; (g) Ofbylding fan spray-droege insulin NP's poeier sûnder mannitol; (h) ôfbylding fan spray-droege insulin NP's poeier mei mannitol.
Tidens it friezedroegjen fungearret mannitol as in kryoprotectant, wêrtroch't NP's yn in amorfe foarm hâlden wurde en skea troch iiskristallen foarkomt19. Yn tsjinstelling, is der gjin friezingstap tidens it sproeidroegjen. Dêrom is mannitol net nedich yn dizze metoade. Eins joegen sproeidroege NP's sûnder mannitol finer NP's lykas earder beskreaun. Mannitol kin lykwols noch altyd fungearje as in filler yn it sproeidroegjenproses om NP's in mear sferyske struktuer te jaan20 (Fig. 2d), wat helpt om in unifoarm frijlittingsgedrach fan sokke ynkapsele NP's te krijen. Derneist is it dúdlik dat guon grutte dieltsjes kinne wurde ûntdutsen yn sawol friezedroege as sproeidroege insuline-NP's dy't mannitol befetsje (Fig. 2b,d), wat kin wêze troch de opgarjen fan mannitol yn 'e dieltsjekearn tegearre mei de ynkapsele insuline. Oan.Chitosanlaach.It is it neamen wurdich dat yn dizze stúdzje, om te soargjen dat de sferyske struktuer yntakt bliuwt nei útdroeging, de ferhâlding fan mannitol en chitosan op 5:1 hâlden wurdt, sadat in grutte hoemannichte filler ek de dieltsjegrutte fan 'e droege NP's fergrutsje kin..
Fourier-transformaasje ynfraread ferswakke totale refleksje (FTIR-ATR) spektroskopie karakterisearre it fysike mingsel fan frije insuline, chitosan, chitosan, TPP en insuline. Alle dehydratisearre NP's waarden karakterisearre mei FTIR-ATR-spektroskopie. Opmerklik waarden bandintensiteiten fan 1641, 1543 en 1412 cm-1 waarnommen yn ynkapsele NP's dy't frieze-droege wiene mei mannitol en yn NP's dy't sproei-droege wiene mei en sûnder mannitol (Fig. 3). Lykas earder rapportearre, wiene dizze ferhegingen yn sterkte assosjeare mei crosslinking tusken chitosan, TPP en insuline. Undersyk nei de ynteraksje tusken chitosan en insuline liet sjen dat yn 'e FTIR-spektra fan insuline-laden chitosan-nanopartikels de chitosanbân oerlaapte mei dy fan insuline, wêrtroch't de karbonylintensiteit (1641 cm-1) en amine (1543 cm-1) riem tanommen. De tripolyfosfaatgroepen fan TPP binne keppele oan ammoniumgroepen yn chitosan, en foarmje in bân by 1412 sm-1.
FTIR-ATR-spektra fan frije insuline, chitosan, fysike mingsels fan chitosan/TPP/insuline en NP's dy't troch ferskate metoaden dehydratisearre binne.
Fierder binne dizze resultaten yn oerienstimming mei dy werjûn yn SEM, dy't oantoande dat de ynkapsele NP's yntakt bleaunen sawol by it spuiten as by it friezen-droegjen mei mannitol, mar yn 'e ôfwêzigens fan mannitol produsearre allinich spuitdrogen ynkapsele dieltsjes. Yn tsjinstelling wiene de FTIR-ATR spektrale resultaten fan NP's dy't sûnder mannitol friezen-droegje wiene tige ferlykber mei it fysike mingsel fan chitosan, TPP en insuline. Dit resultaat jout oan dat de krúsferbiningen tusken chitosan, TPP en insuline net mear oanwêzich binne yn NP's dy't sûnder mannitol friezen-droegje binne. De NP-struktuer waard ferneatige tidens it friezen-droegjen sûnder kryoprotectant, wat te sjen is yn 'e SEM-resultaten (Fig. 2a). Op basis fan 'e morfology en FTIR-resultaten fan dehydratisearre insulin-NP's waarden allinich lyofilisearre, spuitdroge en mannitolfrije NP's brûkt foar rekonstitúsje-eksperiminten en mannitolfrije NP's fanwegen de ûntbining fan mannitolfrije NP's tidens dehydrataasje. besprek.
Dehydrataasje wurdt brûkt foar lange-termyn opslach en werferwurking yn oare formulearringen. It fermogen fan droege NP's om nei opslach te rekonstruearjen is kritysk foar har gebrûk yn ferskate formulearringen lykas tabletten en films. Wy hawwe opmurken dat de gemiddelde dieltsjegrutte fan 'e spuitdroege insulin-NP's yn 'e ôfwêzigens fan mannitol mar in bytsje tanommen is nei rekonstruksje. Oan 'e oare kant naam de dieltsjegrutte fan 'e spuitdroege en gevriesdroege insulin-nanopartikels mei mannitol signifikant ta (Tabel 1). PDI en EE wiene net signifikant feroare (p > 0,05) nei rekombinaasje fan alle NP's yn dizze stúdzje (Tabel 1). Dit resultaat jout oan dat de measte dieltsjes yntakt bleaunen nei it opnij oplossen. De tafoeging fan mannitol resultearre lykwols yn in sterk fermindere insulinbelesting fan lyofilisearre en spuitdroege mannitol-nanopartikels (Tabel 1). Yn tsjinstelling dêrmei bleau de insulinbelestingynhâld fan NP's dy't spuitdroege binne sûnder mannitol itselde as earder (Tabel 1).
It is wolbekend dat it laden fan nanopartikels kritysk is as it brûkt wurdt foar medisynlevering. Foar NP's mei lege ladingen binne tige grutte hoemannichten materiaal nedich om de terapeutyske drompel te berikken. De hege viskositeit fan sokke hege NP-konsintraasjes liedt lykwols ta ûngemak en swierrichheden by orale administraasje en ynjeksjearbere formulearringen, respektivelik 22. Derneist kinne insulin-NP's ek brûkt wurde om tablets en viskeuze biofilms te meitsjen 23, 24, wat it gebrûk fan grutte hoemannichten NP's by lege ladingsnivo's fereasket, wat resulteart yn grutte tablets en dikke biofilms dy't net geskikt binne foar orale tapassingen. Dêrom binne dehydratisearre NP's mei hege insulinlading tige winsklik. Us resultaten suggerearje dat de hege insulinlading fan mannitolfrije spray-droege NP's in protte oantreklike foardielen kin biede foar dizze alternative leveringsmetoaden.
Alle dehydratisearre NP's waarden trije moannen yn 'e kuolkast bewarre. SEM-resultaten lieten sjen dat de morfology fan alle dehydratisearre NP's net signifikant feroare tidens de opslach fan trije moannen (Fig. 4). Nei rekonstitúsje yn wetter lieten alle NP's in lichte ôfname yn EE sjen en frijlitten sawat in lytse hoemannichte (~ 5%) insuline tidens de opslachperioade fan trije moannen (Tabel 2). De gemiddelde dieltsjegrutte fan alle nanopartikels naam lykwols ta. De dieltsjegrutte fan NP's dy't sûnder mannitol spuitdroege waarden, naam ta nei 525 nm, wylst dy fan spuitdroege en friezerdroege NP's mei mannitol tanommen nei respektivelik 872 en 921 nm (Tabel 2).
Morfology fan ferskate dehydratisearre insulin NP's dy't trije moannen opslein binne: (a) SEM-ôfbylding fan lyofilisearre insulin NP's mei mannitol; (b) SEM-ôfbylding fan spray-droege insulin nanopartikels sûnder mannitol; (c) sûnder mannitol SEM-ôfbyldings fan spray-droege insulin NP's.
Fierder waarden delslach sjoen yn 'e rekonstituearre insulin-nanopartikels dy't spuitdroege wiene mei mannitol en friezerdroege (Fig. S2). Dit kin feroarsake wurde troch grutte dieltsjes dy't net goed yn it wetter suspendearje. Al de boppesteande resultaten litte sjen dat de spuitdroegetechnyk insulin-nanopartikels kin beskermje tsjin útdroeging en dat hege ladingen fan insulin-nanopartikels kinne wurde krigen sûnder fillers of kryoprotectanten.
Insulinebehâld waard hifke yn pH = 2.5 medium mei pepsine, trypsine en α-chymotrypsine om it beskermjende fermogen fan NP's tsjin enzymatyske spiisfertarring nei útdroeging oan te toanen. It insulinebehâld fan útdroege NP's waard fergelike mei dat fan farske tariede NP's, en frije insuline waard brûkt as in negative kontrôle. Yn dizze stúdzje liet frije insuline rappe insuline-eliminaasje binnen 4 oeren sjen yn alle trije enzymatyske behannelingen (Fig. 5a-c). Yn tsjinstelling, insuline-eliminaasjetesten fan NP's frieze-droege mei mannitol en NP's spuitdroege mei of sûnder mannitol lieten signifikant hegere beskerming fan dizze NP's sjen tsjin enzymatyske spiisfertarring, wat fergelykber wie mei dy fan farske tariede insuline-NP's (figuer 1).5a-c). Mei help fan nanopartikels yn pepsine, trypsine en α-chymotrypsine koe mear as 50%, 60% en 75% fan insuline binnen respektivelik 4 oeren beskerme wurde (Fig. 5a-c). Dit insuline-beskermjende fermogen kin de kâns op hegere insuline-opname ferheegje. yn 'e bloedstream25. Dizze resultaten suggerearje dat sproeidrogen mei of sûnder mannitol en friezedrogen mei mannitol it insulinbeskermjende fermogen fan NP's nei útdroeging behâlde kin.
Beskerming en frijlittingsgedrach fan dehydratearre insuline-NP's: (a) beskerming fan insuline yn pepsine-oplossing; (b) beskerming fan insuline yn trypsine-oplossing; (c) beskerming fan insuline troch α-chymotrypsine-oplossing; (d) It frijlittingsgedrach fan dehydratearre NP's yn pH = 2.5 oplossing; (e) it frijlittingsgedrach fan dehydratearre NP's yn pH = 6.6 oplossing; (f) it frijlittingsgedrach fan dehydratearre NP's yn pH = 7.0 oplossing.
Farsk taret en rekonstituearre droege insulin-NP's waarden ynkubearre yn ferskate buffers (pH = 2.5, 6.6, 7.0) by 37 °C, wêrby't de pH-omjouwing fan 'e mage, twalfingerige darm en boppeste tinne darm simulearre waarden, om it effekt fan insuline op insulineresistinsje te ûndersykjen. Frijlittingsgedrach yn ferskate omjouwings. Fragmint fan it gastrointestinale traktaat. By pH = 2.5 lieten insuline-laden NP's en opnij oplosbere droege insuline-NP's in earste burstfrijlitting sjen binnen it earste oere, folge troch in stadige frijlitting oer de folgjende 5 oeren (Fig. 5d). Dizze rappe frijlitting oan it begjin is wierskynlik it resultaat fan rappe oerflakdesorpsje fan proteïnemolekulen dy't net folslein immobilisearre binne yn 'e ynterne struktuer fan it dieltsje. By pH = 6.5 lieten insuline-laden NP's en opnij gearstalde droege insuline-NP's in glêde en stadige frijlitting sjen oer 6 oeren, om't de pH fan 'e testoplossing fergelykber wie mei dy fan' e NP's-tariede oplossing (Fig. 5e). By pH = 7 wiene de NP's ynstabyl en hast folslein ûntbûn binnen de earste twa oeren (Fig. 5f). Dit komt om't deprotonaasje fan chitosan plakfynt by hegere pH, wat resulteart yn in minder kompakt polymeernetwurk en frijlitting fan laden insuline.
Fierder lieten de insulin-NP's dy't sûnder mannitol spuitdroege wiene in rapper frijlittingsprofyl sjen as de oare dehydratisearre NP's (Fig. 5d-f). Lykas earder beskreaun, lieten de rekonstituearre insulin-NP's dy't sûnder mannitol droege wiene de lytste dieltsjegrutte sjen. Lytse dieltsjes jouwe in grutter oerflak, sadat it measte fan it relevante medisyn op of tichtby it dieltsjeoerflak sil wêze, wat resulteart yn rappe medisynfrijlitting26.
De cytotoxiciteit fan NP's waard ûndersocht mei in MTT-assay. Lykas te sjen is yn figuer S4, hawwe alle dehydratisearre NP's gjin signifikant effekt op 'e sellibensfetberens by konsintraasjes fan 50-500 μg/ml, wat suggerearret dat alle dehydratisearre NP's feilich brûkt wurde kinne om it terapeutyske finster te berikken.
De lever is it wichtichste oargel wêrtroch't insuline syn fysiologyske funksjes útoefenet. HepG2-sellen binne in minsklike hepatoomselline dy't faak brûkt wurdt as in in vitro hepatocyte-opnamemodel. Hjir waarden HepG2-sellen brûkt om sellulêre opname fan dehydratisearre NP's te beoardieljen mei help fan friezedroeging en spuitdroeging. Sellulêre opname troch konfokale laserscanning mei help fan flowcytometry en fisy nei ferskate oeren ynkubaasje mei frije FITC-insulin by in konsintraasje fan 25 μg/mL, farske tariede FITC-insulin-laden NP's en dehydratisearre FITC-insulin-laden NP's by gelikense insulinkonsintraasjes. Kwantitative mikroskopie (CLSM) observaasjes waarden útfierd. Lyofilisearre NP's sûnder mannitol waarden ferneatige tidens dehydrataasje en waarden net evaluearre yn dizze test. De intrasellulêre fluoreszinsje-yntensiteiten fan farske tariede insulin-laden NP's, lyofilisearre NP's mei mannitol en spuitdroege NP's mei en sûnder mannitol (Fig. 6a) wiene 4,3, 2,6, 2,4 en 4,1 kear heger as de frije. FITC-insulin groep, respektivelik (Fig. 6b). Dizze resultaten suggerearje dat ynkapsele insuline krêftiger is yn sellulêre opname as frije insuline, benammen fanwegen de lytsere grutte fan 'e mei insuline laden nanopartikels produsearre yn 'e stúdzje.
HepG2-selopname nei 4 oeren ynkubaasje mei farske tariede NP's en dehydratisearre NP's: (a) Ferdieling fan FITC-insuline-opname troch HepG2-sellen. (b) Geometrysk gemiddelde fan fluoreszinsje-yntensiteiten analysearre troch flowcytometry (n = 3), *P < 0,05 yn ferliking mei frije insuline.
Likegoed lieten de CLSM-ôfbyldings sjen dat de FITC-fluoreszinsje-yntensiteiten fan farske tariede FITC-ynsuline-laden NP's en FITC-ynsuline-laden spray-droege NP's (sûnder mannitol) folle sterker wiene as dy fan 'e oare samples (Fig. 6a). Fierder, mei de tafoeging fan mannitol, fergrutte de hegere viskositeit fan 'e oplossing de wjerstân tsjin sellulêre opname, wat resultearre yn in fermindere insulinproliferaasje. Dizze resultaten suggerearje dat mannitolfrije spray-droege NP's de heechste sellulêre opname-effisjinsje lieten sjen, om't har dieltsjegrutte lytser wie as dy fan gevriesdroege NP's nei opnij oplossen.
Chitosan (gemiddeld molekulêr gewicht 100 KDa, 75–85% deacetylearre) waard kocht fan Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). Natriumtripolyfosfaat (TPP) waard kocht fan VWR (Radnor, Pennsylvania, Feriene Steaten). Rekombinante minsklike insuline dy't yn dizze stúdzje brûkt waard, wie fan Fisher Scientific (Waltham, MA, Feriene Steaten). Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-labelde minsklike insuline en 4′,6-diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI) waarden kocht fan Sigma-Aldrich. (Oakville, Ontario, Kanada). De HepG2-selline waard krigen fan ATCC (Manassas, Firginia, Feriene Steaten). Alle oare reagentia wiene fan analytyske of chromatografyske kwaliteit.
Tariede in 1 mg/ml CS-oplossing troch it op te lossen yn dûbel destillearre wetter (DD-wetter) mei 0,1% jittiksoer. Tariede 1 mg/ml oplossingen fan TPP en insuline troch se op te lossen yn DD-wetter en 0,1% jittiksoer, respektivelik. De pre-emulsie waard taret mei in polytron PCU-2-110 hege snelheid homogenisator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, Feriene Steaten). It tariedingsproses is as folget: earst wurdt 2 ml TPP-oplossing tafoege oan 4 ml insuline-oplossing, en it mingsel wurdt 30 minuten roerd en folslein mingd. Dêrnei waard de mingde oplossing dripkes foar dripkes tafoege oan de CS-oplossing fia in spuit ûnder hege snelheid roeren (10.000 rpm). De mingsels waarden 30 minuten ûnder hege snelheid roeren (15.000 rpm) yn in iisbad hâlden, en se waarden oanpast oan in bepaalde pH om cross-linked insulin NP's te krijen. Om fierder te homogenisearjen en de dieltsjegrutte fan insulin NP's te ferminderjen, waarden se sonikearre foar in ... ekstra 30 minuten yn in iisbad mei in sonikator fan it sonde-type (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Dútslân).
Insuline-NPS waarden hifke op Z-gemiddelde diameter, polydispersiteitsyndeks (PDI) en zeta-potinsjeel mei dynamyske ljochtfersprieding (DLS) mjittingen mei in Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Eastenryk) troch se te ferdunnen yn DD-wetter by 25 °C. Morfology en grutteferdieling waarden karakterisearre troch in Hitachi H7600 transmissie-elektronenmikroskoop (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan), en ôfbyldings waarden dêrnei analysearre mei Hitachi-ôfbyldingssoftware (Hitachi, Tokio, Japan). Om de ynkapselingseffisjinsje (EE) en laadkapasiteit (LC) fan insuline-NP's te beoardieljen, waarden de NP's yn ultrafiltraasjebuizen pipetteare mei in molekulêre gewichtsgrens fan 100 kDa en sintrifugearre by 500 xg foar 30 minuten. Net-ynkapsele insuline yn it filtraat waard kwantifisearre mei in Agilent 1100 Series HPLC-systeem (Agilent, Santa Clara, Kalifornje, Feriene Steaten) besteande út in kwaternêre pomp, autosampler, kolomferwaarmer en DAD. detektor. Insuline waard analysearre mei in C18-kolom (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, Feriene Steaten) en detektearre by 214 nm. De mobile faze wie acetonitril en wetter, mei 0,1% TFA, gradiëntferhâldingen fan 10/90 oant 100/0, en waard 10 minuten laat rinne. De mobile faze waard pompt mei in streamsnelheid fan 1,0 ml/min. De kolomtemperatuer waard ynsteld op 20 °C. Berekenje de persintaazjes fan EE en LC mei de fergelikingen (1) en Eq. (2).
Ferskate CS/insulin-ferhâldingen fariearjend fan 2.0 oant 4.0 waarden hifke om insuline NP te optimalisearjen. Ferskillende hoemannichten CS-oplossing waarden tafoege tidens de tarieding, wylst it insuline/TPP-mingsel konstant hâlden waard. Insuline NP's waarden taret yn it pH-berik fan 4.0 oant 6.5 troch de pH fan it mingsel soarchfâldich te kontrolearjen nei it tafoegjen fan alle oplossingen (insulin, TPP en CS). De EE en dieltsjegrutte fan insuline-nanopartikels waarden evaluearre by ferskate pH-wearden en CS/insulin-massaferhâldingen om de foarming fan insuline NP's te optimalisearjen.
De optimalisearre insulin NP's waarden op 'e aluminium kontener pleatst en bedekt mei tissue en fêstmakke mei wat tape. Dêrnei waarden de skroefde konteners pleatst yn in Labconco FreeZone friezerdroger (Labconco, Kansas City, MO, Feriene Steaten) foarsjoen fan in traydroger. De temperatuer en fakuümdruk waarden ynsteld op -10 °C, 0.350 Torr foar de earste 2 oeren, en 0 °C en 0.120 Torr foar de oerbleaune 22 oeren fan 'e 24 oeren om droege insulin NP's te krijen.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Switserlân) waard brûkt om ynkapsele insuline te generearjen. De selektearre droechparameters wiene: temperatuer 100 °C, feedstream 3 L/min, en gasstream 4 L/min.
Insuline-NP's foar en nei útdroeging waarden karakterisearre mei FTIR-ATR-spektroskopie. Útdroege nanopartikels, lykas frije insuline en chitosan, waarden analysearre mei in Spectrum 100 FTIR-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Feriene Steaten) foarsjoen fan in universele ATR-sampling-accessoire (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Feriene Steaten). Sinjaalgemiddelden waarden krigen fan 16 scans mei in resolúsje fan 4 cm2 yn it frekwinsjeberik fan 4000-600 cm2.
De morfology fan droege insulin-NP's waard beoardiele troch SEM-ôfbyldings fan gevriesdroege en spuitdroege insulin-NP's dy't waarden fêstlein mei in Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, Feriene Steaten). De wichtichste brûkte parameter wie in spanning fan 5 keV en in stroom fan 30 mA.
Alle dehydratisearre insulin NP's waarden opnij oplost yn dd wetter. Partikelgrutte, PDI, EE en LC waarden opnij hifke mei deselde metoade dy't earder neamd waard om har kwaliteit nei dehydrataasje te beoardieljen. De stabiliteit fan anhydroinsuline NP's waard ek metten troch de eigenskippen fan 'e NP's te testen nei langere opslach. Yn dizze stúdzje waarden alle NP's nei dehydrataasje trije moannen yn 'e kuolkast opslein. Nei trije moannen opslach waarden NP's hifke op morfologyske dieltsjegrutte, PDI, EE en LC.
Los 5 mL fan rekonstituearre NP's op yn 45 mL mei simulearre magefloeistof (pH 1.2, mei 1% pepsine), darmfloeistof (pH 6.8, mei 1% trypsine) of chymotrypsine-oplossing (100 g/mL, yn fosfaatbuffer, pH 7.8) om de effektiviteit fan insuline te evaluearjen by it beskermjen fan NP's nei útdroeging. Se waarden ynkubearre by 37 °C mei in roersnelheid fan 100 rpm. 500 μL fan 'e oplossing waard sammele op ferskate tiidpunten en de insulinkonsintraasje waard bepaald troch HPLC.
It yn vitro frijlittingsgedrach fan farske tariede en dehydratisearre insuline-NP's waard hifke mei de dialysesekmetoade (molekulêre gewichtsgrins 100 kDa, Spectra Por Inc.). Farske tariede en rekonstituearre droege NP's waarden dialysearre yn floeistoffen by pH 2.5, pH 6.6 en pH 7.0 (0.1 M fosfaatbufferde sâltwetter, PBS) om de pH-omjouwing fan 'e mage, twalfingerige darm en boppeste tinne darm te simulearjen. Alle samples waarden ynkubearre by 37 °C mei trochgeand skodzjen by 200 rpm. Aspirearje de floeistof bûten de 5 mL dialysesek op 'e folgjende tiden: 0.5, 1, 2, 3, 4 en 6 oeren, en folje it folume fuortendaliks oan mei farske dialysaat. Insulinefersmoarging yn 'e floeistof waard analysearre troch HPLC, en de snelheid fan insuline-frijlitting út 'e nanopartikels waard berekkene út 'e ferhâlding fan frije insuline frijlitten ta totale insuline ynkapsulearre yn 'e nanopartikels (Fergeliking 3).
Minsklik hepatocellulêre karsinoom-selline HepG2-sellen waarden groeid yn skûtels mei in diameter fan 60 mm mei Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mei 10% fetaal bovine serum, 100 IU/mL penisilline, en 100 μg/mL streptomycine29. Kultueren waarden hâlden by 37 °C, 95% relative fochtigens, en 5% CO2. Foar opname-assays waarden HepG2-sellen siedde mei 1 × 105 sellen/ml op in 8-well Nunc Lab-Tek keamerslidesysteem (Thermo Fisher, NY, FS). Foar cytotoxiciteitsassays waarden se siedde yn 96-wellsplaten (Corning, NY, FS) mei in tichtheid fan 5 × 104 sellen/ml.
De MTT-assay waard brûkt om de cytotoxiciteit fan farske tariede en dehydratisearre insulin NP's30 te evaluearjen. HepG2-sellen waarden siedde yn 96-putplaten mei in tichtheid fan 5 × 104 sellen/mL en 7 dagen foar it testen kultivearre. Insulin NP's waarden ferdund ta ferskate konsintraasjes (50 oant 500 μg/mL) yn kultuermedium en doe oan sellen tadien. Nei 24 oeren ynkubaasje waarden sellen 3 kear wosken mei PBS en ynkubearre mei medium mei 0,5 mg/ml MTT foar noch 4 oeren. Cytotoxiciteit waard beoardiele troch de enzymatyske reduksje fan giele tetrazolium MTT nei pearse formazan te mjitten by 570 nm mei in Tecan infinite M200 pro spektrofotometer plaatlêzer (Tecan, Männedorf, Switserlân).
De sellulêre opname-effisjinsje fan NP's waard hifke troch konfokale laser-scanningmikroskopie en streamcytometry-analyze. Elke put fan it Nunc Lab-Tek keamerslidesysteem waard behannele mei frije FITC-insuline, FITC-insuline-laden NP's, en 25 μg/mL fan dehydratisearre FITC-insuline NP's by deselde konsintraasje opnij gearstald en 4 oeren ynkubearre. Sellen waarden 3 kear wosken mei PBS en fêstmakke mei 4% paraformaldehyde. Kearnen waarden kleurd mei 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Insulinelokalisaasje waard waarnommen mei in Olympus FV1000 laser-scanning/twa-foton konfokale mikroskoop (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japan). Foar streamcytometry-analyze waarden deselde konsintraasjes fan 10 μg/mL frije FITC-insuline, FITC-insuline-laden NP's, en opnij oplosbere dehydratisearre FITC-insuline NP's tafoege oan 96-putplaten siedde mei HepG2-sellen en 4 oeren ynkubearre. oeren. Nei 4 oeren ynkubaasje waarden sellen fuorthelle en 3 kear wosken mei FBS. 5 × 104 sellen per stekproef waarden analysearre mei in BD LSR II flowcytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Feriene Steaten).
Alle wearden wurde útdrukt as gemiddelde ± standertôfwiking. Ferlikings tusken alle groepen waarden beoardiele mei ienwegs ANOVA of t-test troch IBM SPSS Statistics 26 foar Mac (IBM, Endicott, New York, Feriene Steaten) en p < 0.05 waard as statistysk signifikant beskôge.
Dizze stúdzje demonstrearret de fleksibiliteit en it fermogen fan sproeidrogen om cross-linked chitosan/TPP/insulin nanopartikels te dehydrateren mei bettere rekonstitúsje yn ferliking mei standert friezedroegingmetoaden mei bulking aginten of kryoprotectanten, kapasiteit en hegere laadkapasiteit. De optimalisearre insulin nanopartikels joegen in gemiddelde dieltsjegrutte fan 318 nm en in ynkapselingseffisjinsje fan 99,4%. SEM- en FTIR-resultaten nei dehydrataasje lieten sjen dat de sferyske struktuer allinich behâlden waard yn sproeidroege NP's mei en sûnder mannitol en lyofilisearre mei mannitol, mar lyofilisearre NP's sûnder mannitol waarden ûntbûn tidens dehydrataasje. Yn 'e rekonstitúsjefermogenstest lieten insulin nanopartikels dy't sproeidroege wiene sûnder mannitol de lytste gemiddelde dieltsjegrutte en de heechste lading sjen by rekonstitúsje. It frijlittingsgedrach fan al dizze dehydratearre NP's liet sjen dat se rap frijlitten waarden yn oplossingen fan pH = 2,5 en pH = 7, en tige stabyl yn oplossing fan pH = 6,5. Yn ferliking mei oare opnij oploste dehydratearre NP's, de NP's Spray-droege sûnder mannitol liet de rapste frijlitting sjen. Dit resultaat is yn oerienstimming mei dat waarnommen yn 'e sellulêre opname-assay, om't spray-droege NP's yn ôfwêzigens fan mannitol de sellulêre opname-effisjinsje fan farske taret NP's hast folslein behâlden. Dizze resultaten suggerearje dat droege insulin-nanopartikels taret troch mannitolfrije spraydroeging it meast geskikt binne foar fierdere ferwurking yn oare wetterfrije doseringsfoarmen, lykas orale tabletten of bioadhesieve films.
Fanwegen problemen mei yntellektueel eigendom binne de datasets dy't generearre en/of analysearre binne tidens de hjoeddeiske stúdzje net iepenbier beskikber, mar binne se op ridlik fersyk beskikber by de respektive auteurs.
Kagan, A. Type 2-diabetes: sosjale en wittenskiplike oarsprong, medyske komplikaasjes en ymplikaasjes foar pasjinten en oaren. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. De ûntwikkeling fan ynsuline-ynkapseling: is orale administraasje no mooglik? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Resinte foarútgong yn orale insulin-laden liposoom-leveringssystemen foar de behanneling fan diabetes. Ynterpretaasje. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).