Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De ferzje fan 'e browser dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste resultaten riede wy oan dat jo in nijere ferzje fan jo browser brûke (of de kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útskeakelje). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sûnder styling of JavaScript sjen.
Propionsoer (PPA) wurdt brûkt om de rol fan mitochondriale dysfunksje yn neuro-ûntwikkelingssteurnissen lykas autismespektrumstoornis te bestudearjen. PPA is bekend om mitochondriale biogenese, metabolisme en omset te fersteuren. De effekten fan PPA op mitochondriale dynamyk, fisje en fúzje bliuwe lykwols problematysk fanwegen de komplekse tydlike aard fan dizze meganismen. Hjir brûke wy komplementêre kwantitative ôfbyldingstechniken om te ûndersykjen hoe't PPA ynfloed hat op mitochondriale ultrastruktuer, morfology en dynamyk yn neuron-achtige SH-SY5Y-sellen. PPA (5 mM) feroarsake in wichtige ôfname yn mitochondriale oerflak (p < 0.01), fretdiameter en omtrek (p < 0.05), en oerflak 2 (p < 0.01). Mitochondriale event locator-analyze liet in wichtige tanimming (p < 0.05) sjen yn fisje- en fúzje-eveneminten, wêrtroch de yntegriteit fan it mitochondriale netwurk ûnder stressomstannichheden behâlden waard. Derneist wie de mRNA-ekspresje fan cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) en OPA1 (p < 0.05) signifikant fermindere. 01). Dit yllustrearret de ferbouwing fan mitochondriale morfology, biogenese en dynamyk om funksje ûnder stressomstannichheden te behâlden. Us gegevens jouwe nij ynsjoch yn 'e effekten fan PPA op mitochondriale dynamyk en markearje it nut fan ôfbyldingstechniken foar it bestudearjen fan 'e komplekse regeljouwingsmeganismen dy't belutsen binne by mitochondriale stressreaksjes.
Mitochondria binne yntegraal dielnimmers oan in ferskaat oan sellulêre funksjes bûten har typyske rollen yn enerzjyproduksje en biosynteze. Mitochondriale metabolisme is in wichtige regulator fan kalsiumsignalisaasje, metabolike en redokshomeostase, inflammatoire signalisaasje, epigenetyske modifikaasjes, selproliferaasje, differinsjaasje en programmearre seldea1. Yn it bysûnder is mitochondriale metabolisme kritysk foar neuronale ûntwikkeling, oerlibjen en funksje en is breed belutsen by ferskate manifestaasjes fan neuropatology2,3,4.
Yn it ôfrûne desennium is de metabolike status ûntstien as in sintrale regulator fan neurogenese, differinsjaasje, ryping en plastisiteit5,6. Koartlyn binne mitochondriale morfology en dynamyk benammen wichtige komponinten wurden fan mitose, in dynamysk proses dat in pool fan sûne mitochondria binnen sellen ûnderhâldt. Mitochondriale dynamyk wurdt regele troch komplekse ûnderling ôfhinklike paden, fariearjend fan mitochondriale biogenese en bioenergetika oant mitochondriale fisy, fúzje, transport en klaring7,8. Fersteuring fan ien fan dizze yntegrative meganismen beheint it ûnderhâld fan sûne mitochondriale netwurken en hat djipgeande funksjonele gefolgen foar neuroûntwikkeling9,10. Yndied wurdt dysregeling fan mitochondriale dynamyk waarnommen yn in protte psychiatryske, neurodegenerative en neuroûntwikkelingssteurnissen, ynklusyf autismespektrumsteurnissen (ASS)11,12.
ASS is in heterogene neuro-ûntwikkelingssteuring mei in komplekse genetyske en epigenetyske arsjitektuer. De erflikens fan ASS is ûnbestriden, mar de ûnderlizzende molekulêre etiology bliuwt min begrepen. It sammeljen fan gegevens út preklinyske modellen, klinyske stúdzjes en multi-omics molekulêre datasets leverje tanimmend bewiis fan mitochondriale dysfunksje yn ASS13,14. Wy hawwe earder in genoomwide DNA-metylaasjescreening útfierd yn in kohort fan pasjinten mei ASS en identifisearren ferskillend metylearre genen klustere lâns mitochondriale metabolike paden15. Wy hawwe dêrnei ferskillende metylaasje fan sintrale regulators fan mitochondriale biogenese en dynamyk rapportearre, wat assosjeare waard mei in ferhege mtDNA-kopynûmer en in feroare urinemetabolysk profyl yn ASS16. Us gegevens leverje tanimmend bewiis dat mitochondriale dynamyk en homeostase in sintrale rol spylje yn 'e patofysiology fan ASS. Dêrom is it ferbetterjen fan it mechanistyske begryp fan 'e relaasje tusken mitochondriale dynamyk, morfology en funksje in wichtich doel fan oanhâldend ûndersyk nei neurologyske sykten karakterisearre troch sekundêre mitochondriale dysfunksje.
Molekulêre techniken wurde faak brûkt om de rol fan spesifike genen yn mitochondriale stressreaksjes te bestudearjen. Dizze oanpak kin lykwols beheind wurde troch de mearfâldige en tydlike aard fan mitoatyske kontrôlemeganismen. Boppedat is differinsjele ekspresje fan mitochondriale genen in yndirekte yndikator fan funksjonele feroarings, foaral om't typysk mar in beheind oantal genen analysearre wurde. Dêrom binne mear direkte metoaden foar it bestudearjen fan mitochondriale funksje en bioenergetika foarsteld17. Mitochondriale morfology is nau besibbe oan mitochondriale dynamyk. Mitochondriale foarm, ferbining en struktuer binne kritysk foar enerzjyproduksje en mitochondriale en sel-oerlibjen5,18. Boppedat rjochtsje de ferskate komponinten fan mitose har op feroarings yn mitochondriale morfology, dy't kinne tsjinje as nuttige einpunten fan mitochondriale dysfunksje en in basis leverje foar folgjende mechanistyske stúdzjes.
Mitochondriale morfology kin direkt waarnommen wurde mei transmissie-elektronenmikroskopie (TEM), wêrtroch detaillearre stúdzje fan sellulêre ultrastruktuer mooglik is. TEM visualisearret direkt de morfology, foarm en struktuer fan mitochondriale cristae by de resolúsje fan yndividuele mitochondria, ynstee fan allinich te fertrouwen op gentranskripsje, proteïne-ekspresje of mitochondriale funksjonele parameters yn selpopulaasjes17,19,20. Derneist fasilitearret TEM de stúdzje fan ynteraksjes tusken mitochondria en oare organellen, lykas it endoplasmatysk reticulum en autofagosomen, dy't wichtige rollen spylje yn mitochondriale funksje en homeostase21,22. Dit makket TEM dus in goed útgongspunt foar it bestudearjen fan mitochondriale dysfunksje foardat jo rjochtsje op spesifike paden of genen. Om't mitochondriale funksje hieltyd relevanter wurdt foar neuropatology, is d'r in dúdlike needsaak om mitochondriale morfology en dynamyk direkt en kwantitatyf te bestudearjen yn in vitro neuronale modellen.
Yn dit artikel ûndersiikje wy mitochondriale dynamyk yn in neuronaal model fan mitochondriale dysfunksje by autismespektrumstoornis. Wy hawwe earder differinsjele metylaasje fan propionyl-CoA-karboksylase beta (PCCB) rapportearre yn ASD15, in subeenheid fan it mitochondriale propionyl-CoA-karboksylase-enzym PCC. Dysregeling fan PCC is bekend om giftige opgarjen fan propionylderivaten te feroarsaakjen, ynklusyf propionsoer (PPA)23,24,25. PPA is oantoand om neuronale metabolisme te fersteuren en gedrach yn vivo te feroarjen en is in fêstige diermodel foar it bestudearjen fan neuro-ûntwikkelingsmeganismen dy't belutsen binne by ASD26,27,28. Derneist is rapportearre dat PPA mitochondriale membraanpotinsjeel, biogenese en respiraasje yn vitro fersteurt en is breed brûkt om mitochondriale dysfunksje yn neuronen te modellearjen29,30. De ynfloed fan PPA-induzearre mitochondriale dysfunksje op mitochondriale morfology en dynamyk bliuwt lykwols min begrepen.
Dizze stúdzje brûkt komplementêre ôfbyldingstechniken om de effekten fan PPA op mitochondriale morfology, dynamyk en funksje yn SH-SY5Y-sellen te kwantifisearjen. Earst hawwe wy in TEM-metoade ûntwikkele om feroaringen yn mitochondriale morfology en ultrastruktuer te visualisearjen17,31,32. Mei it each op de dynamyske aard fan mitochondria33, hawwe wy ek mitochondriale evenemintlokalisator (MEL)-analyze brûkt om feroaringen yn 'e lykwicht tusken fisy- en fúzje-eveneminten, mitochondriale oantal en folume ûnder PPA-stress te kwantifisearjen. Uteinlik hawwe wy ûndersocht oft mitochondriale morfology en dynamyk ferbûn binne mei feroaringen yn 'e ekspresje fan genen dy't belutsen binne by biogenese, fisy en fúzje. Mei-inoar yllustrearje ús gegevens de útdaging om de kompleksiteit fan 'e meganismen dy't mitochondriale dynamyk regelje, te ferdúdlikjen. Wy markearje it nut fan TEM by it bestudearjen fan mitochondriale morfology as in mjitber konvergint einpunt fan mitose yn SH-SY5Y-sellen. Derneist markearje wy dat TEM-gegevens de rykste ynformaasje leverje as se kombineare wurde mei ôfbyldingstechniken dy't ek dynamyske eveneminten fêstlizze yn reaksje op metabolike stress. Fierdere karakterisaasje fan 'e molekulêre regeljouwingsmeganismen dy't neuronale selmitose stypje, kin wichtich ynsjoch jaan yn 'e mitochondriale komponint fan it senuwstelsel en neurodegenerative sykten.
Om mitochondriale stress te indusearjen, waarden SH-SY5Y-sellen behannele mei PPA mei 3 mM en 5 mM natriumpropionaat (NaP). Foar TEM waarden de samples ûnderwurpen oan kryogene sample tarieding mei hege druk befriezen en befriezen (Fig. 1a). Wy ûntwikkelen in automatisearre mitochondriale ôfbyldingsanalysepipeline om acht morfologyske parameters fan mitochondriale populaasjes oer trije biologyske replikaten te mjitten. Wy fûnen dat PPA-behanneling fjouwer parameters signifikant feroare: gebiet 2, gebiet, perimeter en Feret-diameter (Fig. 1b-e). Gebiet 2 naam signifikant ôf mei sawol 3 mM as 5 mM PPA-behanneling (p = 0.0183 en p = 0.002, respektivelik) (Fig. 1b), wylst gebiet (p = 0.003), perimeter (p = 0.0106) en Feret-diameter allegear signifikant ôfnommen binne. Der wie in signifikante reduksje (p = 0.0172) yn 'e 5 mM-behannelinggroep yn ferliking mei de kontrôlegroep (Fig. 1c-e). Signifikante ferminderingen yn oerflak en omtrek lieten sjen dat sellen behannele mei 5 mM PPA lytsere, mear rûne mitochondria hiene, en dat dizze mitochondria minder langwerpich wiene as dy yn kontrôlesellen. Dit is ek yn oerienstimming mei in wichtige fermindering fan 'e Feret-diameter, in ûnôfhinklike parameter dy't in fermindering fan 'e grutste ôfstân tusken dieltsjerânen oanjout. Feroarings yn 'e ultrastruktuer fan 'e cristae waarden waarnommen: de cristae waarden minder útsprutsen ûnder ynfloed fan PPA-stress (Fig. 1a, paniel B). Net alle ôfbyldings reflektearren lykwols dúdlik de ultrastruktuer fan 'e cristae, dus in kwantitative analyze fan dizze feroarings waard net útfierd. Dizze TEM-gegevens kinne trije mooglike senario's reflektearje: (1) PPA fersterket fisy of remt fúzje, wêrtroch besteande mitochondria yn grutte krimpje; (2) ferbettere biogenese makket nije, lytsere mitochondria of (3) ynducearret beide meganismen tagelyk. Hoewol dizze omstannichheden net ûnderskieden wurde kinne troch TEM, jouwe wichtige morfologyske feroarings feroarings oan yn mitochondriale homeostase en dynamyk ûnder PPA-stress. Wy hawwe dêrnei ekstra parameters ûndersocht om dizze dynamyk en de potinsjele meganismen dy't derûnder lizze fierder te karakterisearjen.
Propionzuur (PPA) fernijt mitochondriale morfology. (a) Represintative transmissie-elektronenmikroskopie (TEM) ôfbyldings dy't sjen litte dat mitochondriale grutte ôfnimt en mitochondria lytser en rûner wurde mei tanimmende PPA-behanneling; 0 mM (ûnbehannele), 3 mM en 5 mM, respektivelik. Reade pylken jouwe mitochondria oan. (b-e) SH-SY5Y-sellen behannele mei PPA foar 24 oeren waarden taret foar TEM en de resultaten waarden analysearre mei Fiji/ImageJ. Fjouwer fan 'e acht parameters lieten wichtige ferskillen sjen tusken kontrôle (ûnbehannele, 0 mM PPA) en behannele (3 mM en 5 mM PPA) sellen. (b) Regio 2, (c) Gebiet, (d) Perimeter, (e) Feretdiameter. Ienrjochtingsanalyse fan fariânsje (kontrôle vs. behanneling) en Dunnett's meardere fergelikingstest waarden brûkt om wichtige ferskillen te bepalen (p < 0,05). Datapunten fertsjintwurdigje de gemiddelde mitochondriale wearde foar elke yndividuele sel, en flaterbalken fertsjintwurdigje it gemiddelde ± SEM. De werjûne gegevens fertsjintwurdigje n = 3, teminsten 24 sellen per replikaat; in totaal fan 266 ôfbyldings waarden analysearre; * jout p < 0.05 oan, ** jout p < 0.01 oan.
Om fierder te karakterisearjen hoe't mitochondriale dynamyk reagearret op PPA, hawwe wy mitochondria kleurd mei tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) en time-lapse mikroskopie en MEL-analyze brûkt om mitochondria te lokalisearjen en te kwantifisearjen nei 24 oeren by 3 en 5 mM PPA. Behanneling fan fisje- en fúzje-eveneminten. (Fig. 2a). Nei MEL-analyze waarden mitochondria fierder analysearre om it oantal mitochondriale struktueren en har gemiddelde folume te kwantifisearjen. Wy seagen in lytse mar wichtige tanimming yn it oantal fisje-eveneminten dy't foelen by 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] yn ferliking mei fisje [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] en fúzje [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] en fúzje [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] eveneminten wiene signifikant ferhege by 5 mM yn ferliking mei kontrôle (Fig. 3b). It oantal mitochondria naam signifikant ta by sawol 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] as 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), wylst it gemiddelde folume fan elke mitochondriale struktuer net feroare bleau (Fig. 3c). 3d). Mei-inoar suggerearret dit dat it ferbouwen fan mitochondriale dynamyk tsjinnet as in kompensatoaryske reaksje dy't de yntegriteit fan it mitochondriale netwurk mei súkses behâldt. De tanimming fan it oantal fisje-eveneminten by 3 mM PPA suggerearret dat de tanimming fan it oantal mitochondria foar in part te tankjen is oan mitochondriale fisje, mar sjoen dat it gemiddelde mitochondriale folume yn essinsje net feroaret, kin biogenese net útsletten wurde as in ekstra kompensatoaryske reaksje. Dizze gegevens binne lykwols yn oerienstimming mei de lytsere, rûne mitochondriale struktueren dy't waarnommen binne troch TEM en litte ek wichtige feroaringen sjen yn mitochondriale dynamyk feroarsake troch PPA.
Propionzuur (PPA) feroarsaket dynamyske mitochondriale remodeling om de netwurkintegriteit te behâlden. SH-SY5Y-sellen waarden kultivearre, behannele mei 3 en 5 mM PPA foar 24 oeren en kleurd mei TMRE en Hoechst 33342, folge troch MEL-analyze. (a) Represintative time-lapse mikroskopyôfbyldings dy't kleur en binêre maksimale yntensiteitsprojeksjes op tiid 2 (t2) foar elke tastân ôfbylde. Selektearre regio's oanjûn yn elke binêre ôfbylding wurde ferbettere en werjûn yn 3D op trije ferskillende tiidframes (t1-t3) om de dynamyk oer tiid te yllustrearjen; fúzje-eveneminten binne markearre yn grien; fisy-eveneminten binne markearre yn grien. Werjûn yn read. (b) Gemiddeld oantal dynamyske eveneminten per tastân. (c) Gemiddeld oantal mitochondriale struktueren per sel. (d) Gemiddeld folume (µm3) fan elke mitochondriale struktuer per sel. De werjûne gegevens binne fertsjintwurdigjend foar n = 15 sellen per behannelinggroep. De werjûne flaterbalken fertsjintwurdigje gemiddelde ± SEM, skaalbalke = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsoer (PPA) feroarsaket transkripsjonele ûnderdrukking fan genen dy't ferbûn binne mei mitochondriale dynamyk. SH-SY5Y-sellen waarden 24 oeren behannele mei 3 en 5 mM PPA. Relative genkwantifikaasje waard útfierd mei RT-qPCR en normalisearre nei B2M. Mitochondriale biogenese-genen (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 en (d) NFE2L2. Mitochondriale fúzje- en fissie-genen (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 en (i) DRP1. Signifikante ferskillen (p < 0,05) waarden hifke mei ienwegs ANOVA (kontrôle vs. behanneling) en Dunnett's meardere fergelikingstest: * jout p < 0,05 oan, ** jout p < 0,01 oan, en **** jout p < 0,0001 oan. Balken fertsjintwurdigje gemiddelde ekspresje ± SEM. De werjûne gegevens fertsjintwurdigje biologyske replikaten fan n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), en n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Gegevens fan TEM- en MEL-analyses jouwe tegearre oan dat PPA de mitochondriale morfology en dynamyk feroaret. Dizze ôfbyldingstechniken jouwe lykwols gjin ynsjoch yn 'e ûnderlizzende meganismen dy't dizze prosessen oandriuwe. Dêrom hawwe wy de mRNA-ekspresje ûndersocht fan njoggen wichtige regulators fan mitochondriale dynamyk, biogenese en mitose as reaksje op PPA-behanneling. Wy kwantifisearren selmyeloma-onkogen (cMYC), nukleêre respiratoire faktor (NRF1), mitochondriale transkripsjefaktor 1 (TFAM), NFE2-like transkripsjefaktor BZIP (NFE2L2), gastrine-like proteïne 2 (STOML2), optyske senuwatrofie 1 (OPA1), Mitofusine 1 (MFN1), Mitofusine 2 (MFN2) en dynamin-relatearre proteïne 1 (DRP1) nei 24 oeren behanneling mei 3 mM en 5 mM PPA. Wy observearren 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 en p < 0.0001, respektivelik) en 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA-behanneling. (Fig. 3a-c). De ôfname yn mRNA-ekspresje wie dosisôfhinklik: de ekspresje fan cMYC, NRF1 en TFAM naam ôf mei 5.7, 2.6 en 1.9 kear by 3 mM, respektivelik, en mei 11.2, 3 en 2.2 kear by 5 mM. Yn tsjinstelling, waard it sintrale redoksbiogenese-gen NFE2L2 net feroare by hokker konsintraasje fan PPA dan ek, hoewol in ferlykbere dosisôfhinklike trend fan fermindere ekspresje waard waarnommen (Fig. 3d).
Wy hawwe ek de ekspresje ûndersocht fan klassike genen dy't belutsen binne by de regeling fan fisy en fúzje. STOML2 wurdt tocht belutsen te wêzen by fúzje, mitofagy en biogenese, en de ekspresje dêrfan waard signifikant fermindere (p < 0.0001) mei 3 mM (2.4-fâldige feroaring) en 5 mM (2.8-fâldige feroaring) PPA (Fig. 1). 3d). Op deselde wize waard de ekspresje fan it OPA1-fúzjegen fermindere by 3 mM (1.6-fâldige feroaring) en 5 mM (1.9-fâldige feroaring) PPA (p = 0.006 en p = 0.0024, respektivelik) (Fig. 3f). Wy fûnen lykwols gjin wichtige ferskillen yn 'e ekspresje fan fúzjegenen MFN1, MFN2 of fisygen DRP1 ûnder 24-oere PPA-stress (Fig. 3g-i). Derneist hawwe wy fûn dat de nivo's fan fjouwer fúzje- en fisyproteïnen (OPA1, MFN1, MFN2 en DRP1) net feroaren ûnder deselde omstannichheden (Fig. 4a-d). It is wichtich om te notearjen dat dizze gegevens ien punt yn 'e tiid reflektearje en miskien gjin feroarings yn proteïne-ekspresje of aktiviteitsnivo's reflektearje tidens de iere stadia fan PPA-stress. Signifikante ferminderingen yn 'e ekspresje fan cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 jouwe lykwols oan dat der in wichtige transkripsjonele dysregeling is fan mitochondriale metabolisme, biogenese en dynamyk. Derneist markearje dizze gegevens it nut fan ôfbyldingstechniken om direkt feroarings yn 'e eintastân fan mitochondriale funksje te bestudearjen.
De fúzje- en fisyfaktorproteïnenivo's feroaren net nei behanneling mei propionzuur (PPA). SH-SY5Y-sellen waarden 24 oeren behannele mei 3 en 5 mM PPA. Proteïnenivo's waarden kwantifisearre troch Western blot-analyze, en ekspresjenivo's waarden normalisearre nei totale proteïne. Gemiddelde proteïne-ekspresje en represintative Western blots fan doel- en totale proteïne wurde werjûn. a - OPA1, b - MFN1, c - MFN2, d - DRP1. Balken fertsjintwurdigje gemiddelde ± SEM, en de werjûne gegevens binne represintatyf foar n = 3 biologyske replikaten. Meardere fergelikingen (p < 0,05) waarden útfierd mei ienwegsfariansje-analyze en Dunnett's test. De orizjinele gel en blot wurde werjûn yn figuer S1.
Mitochondriale dysfunksje wurdt assosjeare mei multisysteemsykten, fariearjend fan metabolike, kardiovaskulêre en spiersykten oant neurologyske sykten1,10. In protte neurodegenerative en neurodegenerative sykten wurde assosjeare mei mitochondriale dysfunksje, wat it belang fan dizze organellen yn 'e heule libbensdoer fan' e harsens beklammet. Dizze sykten omfetsje de sykte fan Parkinson, de sykte fan Alzheimer en ASS3,4,18. Tagong ta harsensweefsel om dizze sykten te bestudearjen is lykwols lestich, foaral op it mechanistyske nivo, wêrtroch sellulêre modelsystemen in needsaaklik alternatyf binne. Yn dizze stúdzje brûke wy in sellulêr modelsysteem mei PPA-behannele SH-SY5Y-sellen om de mitochondriale dysfunksje te rekapitulearjen dy't waarnommen wurdt yn neuronale sykten, benammen autismespektrumstoornissen. It brûken fan dit PPA-model om mitochondriale dynamyk yn neuronen te bestudearjen kin ynsjoch jaan yn 'e etiology fan ASS.
Wy hawwe de mooglikheid ûndersocht om TEM te brûken om feroaringen yn mitochondriale morfology te besjen. It is wichtich om te notearjen dat TEM korrekt brûkt wurde moat om syn effektiviteit te maksimalisearjen. De tarieding fan kryo-eksimplaren makket bettere behâld fan neuronale struktueren mooglik troch tagelyk sellulêre komponinten te fixearjen en de foarming fan artefakten te ferminderjen34. Yn oerienstimming hjirmei hawwe wy waarnommen dat neuron-like SH-SY5Y-sellen yntakte subsellulêre organellen en langwerpige mitochondria hiene (Fig. 1a). Dit markearret it nut fan kryogene tariedingstechniken foar it bestudearjen fan mitochondriale morfology yn neuronale selmodellen. Hoewol kwantitative mjittingen kritysk binne foar objektive analyze fan TEM-gegevens, is d'r noch gjin konsensus oer hokker spesifike parameters moatte wurde metten om mitochondriale morfologyske feroaringen te befêstigjen. Op basis fan in grut oantal stúdzjes dy't kwantitatyf mitochondriale morfology17,31,32 ûndersocht hawwe, hawwe wy in automatisearre mitochondriale ôfbyldingsanalysepipeline ûntwikkele dy't acht morfologyske parameters mjit, nammentlik: oerflak, oerflak2, aspektferhâlding, perimeter, sirkelfoarmigens, graad, Feret-diameter en rûnens.
Under harren fermindere PPA gebiet 2, gebiet, perimeter en Feret-diameter signifikant (Fig. 1b-e). Dit liet sjen dat mitochondria lytser en rûner waarden, wat oerienkomt mei eardere stúdzjes dy't in ôfname yn mitochondriale gebiet sjen litte nei 72 oeren fan PPA30-induzearre mitochondriale stress. Dizze morfologyske skaaimerken kinne wize op mitochondriale fisy, in needsaaklik proses om beskeadige komponinten út it mitochondriale netwurk te sekwestrearjen om har degradaasje troch mitofagy te befoarderjen35,36,37. Oan 'e oare kant kin de ôfname yn gemiddelde mitochondriale grutte assosjeare wurde mei ferhege biogenese, wat resulteart yn 'e foarming fan lytse ûntwikkeljende mitochondria. Ferhege fisy of biogenese fertsjintwurdiget in kompensatoaryske reaksje om mitose te behâlden tsjin mitochondriale stress. Fermindere mitochondriale groei, beheinde fúzje of oare omstannichheden kinne lykwols net útsletten wurde.
Hoewol't de hege-resolúsje ôfbyldings makke troch TEM de bepaling fan morfologyske skaaimerken op it nivo fan yndividuele mitochondria mooglik meitsje, produseart dizze metoade twadiminsjonale snapshots op ien punt yn 'e tiid. Om dynamyske reaksjes op metabolike stress te bestudearjen, hawwe wy mitochondria kleurd mei TMRE en time-lapse mikroskopie mei MEL-analyze brûkt, wat hege-trochput 3D-visualisaasje fan feroaringen yn it mitochondriale netwurk oer tiid mooglik makket33,38. Wy observearren subtile mar wichtige feroaringen yn mitochondriale dynamyk ûnder PPA-stress (Fig. 2). By 3 mM naam it oantal fisy-eveneminten signifikant ta, wylst fúzje-eveneminten itselde bleaunen as yn 'e kontrôle. In tanimming fan it oantal sawol fisy- as fúzje-eveneminten waard waarnommen by 5 mM PPA, mar dizze feroaringen wiene sawat evenredich, wat suggerearret dat fisy- en fúzjekinetyk lykwicht berikke by hegere konsintraasjes (Fig. 2b). It gemiddelde mitochondriale folume bleau ûnferoare by sawol 3 as 5 mM PPA, wat oanjout dat de yntegriteit fan it mitochondriale netwurk bewarre bleaun is (Fig. 2d). Dit reflektearret it fermogen fan dynamyske mitochondriale netwurken om te reagearjen op milde metabolike stress om effektyf homeostase te behâlden sûnder netwurkfragmentaasje te feroarsaakjen. By 3 mM PPA is de tanimming fan fisje genôch om de oergong nei in nij lykwicht te befoarderjen, mar djipgeande kinetische remodeling is fereaske as reaksje op stress feroarsake troch hegere konsintraasjes fan PPA.
It oantal mitochondria naam ta by beide PPA-stresskonsintraasjes, mar it gemiddelde mitochondriale folume feroare net signifikant (Fig. 2c). Dit kin te tankjen wêze oan ferhege biogenese of ferhege dieling; lykwols, yn 'e ôfwêzigens fan in signifikante ôfname yn gemiddeld mitochondriale folume, is it wierskynliker dat biosynteze tanimt. De gegevens yn Figuer 2 stypje lykwols it bestean fan twa kompensatoaryske meganismen: in tanimming fan it oantal fisje-eveneminten, yn oerienstimming mei opregulearring fan mitochondriale fisje, en in tanimming fan it oantal eveneminten, yn oerienstimming mei mitochondriale biogenese. Uteinlik kin dynamyske kompensaasje foar milde stress bestean út simultane prosessen dy't fisje, fúzje, biogenese en mitofagy omfetsje. Hoewol eardere auteurs hawwe oantoand dat PPA mitose30,39 en mitofagy29 fersterket, leverje wy bewiis foar remodelling fan mitochondriale fisje- en fúzjedynamika yn reaksje op PPA. Dizze gegevens befêstigje de morfologyske feroarings dy't waarnommen binne troch TEM en jouwe fierder ynsjoch yn 'e meganismen dy't ferbûn binne mei PPA-induzearre mitochondriale dysfunksje.
Omdat noch TEM noch MEL-analyze direkt bewiis levere fan 'e genregulearjende meganismen dy't ûnderlizze oan 'e waarnommen morfologyske feroarings, hawwe wy de RNA-ekspresje ûndersocht fan genen dy't belutsen binne by mitochondriale metabolisme, biogenese en dynamyk. It cMYC-proto-onkogene is in transkripsjefaktor dy't belutsen is by de regeling fan mitochondria, glykolyse, aminosoer- en fetsoermetabolisme40. Derneist is bekend dat cMYC de ekspresje regelt fan hast 600 mitochondriale genen dy't belutsen binne by mitochondriale transkripsje, oersetting en komplekse gearstalling, ynklusyf NRF1 en TFAM41. NRF1 en TFAM binne twa sintrale regulators fan mitose, dy't streamôfwerts fan PGC-1α wurkje om mtDNA-replikaasje te aktivearjen. Dizze paad wurdt aktivearre troch cAMP- en AMPK-sinjalearring en is gefoelich foar enerzjyútjeften en metabolike stress. Wy hawwe ek NFE2L2 ûndersocht, in redoksregulator fan mitochondriale biogenese, om te bepalen oft de effekten fan PPA bemiddele wurde kinne troch oksidative stress.
Hoewol't NFE2L2-ekspresje net feroare bleau, fûnen wy in konsekwinte dosisôfhinklike ôfname yn 'e ekspresje fan cMYC, NRF1 en TFAM nei 24 oeren behanneling mei 3 mM en 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Downregulaasje fan cMYC-ekspresje is earder rapportearre as in reaksje op mitochondriale stress42, en oarsom kin downregulaasje fan cMYC-ekspresje mitochondriale dysfunksje feroarsaakje troch it remodellearjen fan mitochondriale metabolisme, netwurkferbining en membraanpolarisaasje43. Nijsgjirrich is dat cMYC ek belutsen is by de regeling fan mitochondriale fisje en fúzje42,43 en is bekend om DRP1-fosforylaasje en mitochondriale lokalisaasje te ferheegjen tidens seldieling44, en ek mitochondriale morfologyske remodelling yn neuronale stamsellen45 te bemiddeljen. Yndied, cMYC-tekoart fibroblasten litte in fermindere mitochondriale grutte sjen, yn oerienstimming mei feroaringen feroarsake troch PPA43-stress. Dizze gegevens yllustrearje in nijsgjirrige, mar noch ûndúdlike relaasje tusken cMYC en mitochondriale dynamyk, en leverje in nijsgjirrich doelwyt foar takomstige stúdzjes fan PPA-stress-induzearre remodelling.
De reduksje fan NRF1 en TFAM is yn oerienstimming mei de rol fan cMYC as in wichtige transkripsjonele aktivator. Dizze gegevens binne ek yn oerienstimming mei eardere stúdzjes yn minsklike darmkankersellen dy't oantoane dat PPA de NRF1 mRNA-ekspresje nei 22 oeren fermindere, wat assosjeare waard mei ATP-útputting en ferhege ROS46. Dizze auteurs rapportearren ek dat TFAM-ekspresje nei 8,5 oeren tanommen wie, mar nei 22 oeren weromkaam nei basisnivo's. Yn tsjinstelling, Kim et al. (2019) lieten sjen dat TFAM mRNA-ekspresje signifikant ôfnaam wie nei 4 oeren PPA-stress yn SH-SY5Y-sellen; nei 72 oeren wie de TFAM-proteïne-ekspresje lykwols signifikant ferhege en it mtDNA-kopynûmer wie signifikant ferhege. Sa slút de ôfname yn it oantal mitochondriale biogenese-genen dy't wy nei 24 oeren waarnommen hawwe, de mooglikheid net út dat de tanimming fan it oantal mitochondria assosjeare is mei aktivearring fan biogenese op eardere tiidpunten. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat PPA PGC-1α mRNA en proteïne yn SH-SY5Y-sellen signifikant opregulearret nei 4 oeren en 30 minuten, wylst propionzuur mitochondriale biogenese yn keallehpatocyten ferbetteret fia PGC-1α nei 12 oeren en 39 minuten. Nijsgjirrich is dat PGC-1α net allinich in direkte transkripsjonele regulator is fan NRF1 en TFAM, mar ek oantoand is dat it de aktiviteit fan MFN2 en DRP1 regulearret troch fisy en fúzje te regeljen47. Mei-inoar nommen markearret dit de nauwe koppeling fan meganismen dy't mitochondriale kompensatoaryske reaksjes regelje dy't troch PPA feroarsake wurde. Boppedat reflektearje ús gegevens wichtige dysregeling fan transkripsjonele regeling fan biogenese en metabolisme ûnder PPA-stress.
De STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- en DRP1-genen binne ûnder de sintrale regulators fan mitochondriale fisy, fúzje en dynamyk37,48,49. Der binne in protte oare genen belutsen by mitochondriale dynamyk, lykwols binne STOML2, OPA1 en MFN2 earder fûn om ferskillend metylearre te wêzen yn ASD-kohorten,16 en ferskate ûnôfhinklike stúdzjes hawwe feroaringen yn dizze transkripsjefaktoaren rapportearre as reaksje op mitochondriale stress50,51.52. De ekspresje fan sawol OPA1 as STOML2 waard signifikant fermindere troch 3 mM en 5 mM PPA-behanneling (Fig. 3e, f). OPA1 is ien fan 'e klassike regulators fan mitochondriale fúzje troch direkte ynteraksje mei MFN1 en 2 en spilet in rol yn cristae-remodeling en mitochondriale morfology53. De krekte rol fan STOML2 yn mitochondriale dynamyk bliuwt ûndúdlik, mar bewiis suggerearret dat it in rol spilet yn mitochondriale fúzje, biogenese en mitofagy.
STOML2 is belutsen by it behâld fan mitochondriale respiratoire koppeling en de foarming fan respiratoire ketenkompleksen54,55 en it is oantoand dat it de metabolike skaaimerken fan kankersellen djipgeand feroaret56. Undersyk hat oantoand dat STOML2 mitochondriale membraanpotinsjeel en biogenese befoarderet troch ynteraksje mei BAN en kardiolipine 55, 57, 58. Derneist hawwe ûnôfhinklike ûndersiken oantoand dat de ynteraksje tusken STOML2 en PINK1 mitofagy regulearret59,60. It is opmerklik dat STOML2 direkt ynteraksje hat mei en MFN2 stabilisearret en ek in wichtige rol spilet by it stabilisearjen fan lange OPA1-isoformen troch it remmen fan 'e protease dy't ferantwurdlik is foar OPA1-ôfbraak53,61,62. De fermindering fan STOML2-ekspresje waarnommen yn PPA-reaksjes kin dizze fúzjeproteinen gefoeliger meitsje foar ôfbraak fia ubiquitine- en proteasoom-ôfhinklike paden48. Hoewol de krekte rol fan STOML2 en OPA1 yn 'e dynamyske reaksje op PPA ûndúdlik is, kin fermindere ekspresje fan dizze fúzjegenen (figuer 3) it lykwicht tusken fisy en fúzje fersteure en liede ta in fermindere mitochondriale grutte (figuer 3). 1).
Oan 'e oare kant bleau de ekspresje fan OPA1-proteïne nei 24 oeren net feroare, wylst de mRNA- en proteïnenivo's fan MFN1, MFN2 of DRP1 net signifikant feroaren nei PPA-behanneling (Fig. 3g-i, Fig. 4). Dit kin oanjaan dat der gjin feroarings binne yn 'e regeling fan dizze faktoaren dy't belutsen binne by mitochondriale fúzje en fisy. It is lykwols it neamen wurdich dat elk fan dizze fjouwer genen ek regele wurdt troch posttranskripsjonele modifikaasjes (PTM's) dy't proteïneaktiviteit kontrolearje. OPA1 hat acht alternative splitsfarianten dy't proteolytysk spjalte wurde yn mitochondria om twa ûnderskate isoformen te produsearjen 63. De lykwicht tusken lange en koarte isoformen bepaalt úteinlik de rol fan OPA1 yn mitochondriale fúzje en ûnderhâld fan it mitochondriale netwurk64. DRP1-aktiviteit wurdt regele troch kalsium/calmodulin-ôfhinklike proteïnekinase II (CaMKII) fosforylaasje, wylst DRP1-ôfbraak regele wurdt troch ubiquitinaasje en SUMOylaasje65. Uteinlik binne sawol DRP1 as MFN1/2 GTPases, dus aktiviteit kin beynfloede wurde troch de snelheid fan GTP-produksje yn mitochondria 66. Dêrom, hoewol de ekspresje fan dizze proteïnen konstant bliuwt, kin dit miskien net de ûnferoare proteïneaktiviteit of lokalisaasje reflektearje 67,68. Yndied, besteande PTM-proteïnerepertoires tsjinje faak as de earste ferdigeningsline dy't ferantwurdlik is foar it bemiddeljen fan akute stressreaksjes. Yn 'e oanwêzigens fan matige metabolike stress yn ús model is it wierskynlik dat PTM ferhege aktiviteit fan fúzje- en fisyproteïnen befoarderet om mitochondriale yntegriteit genôch te herstellen sûnder ekstra aktivearring fan dizze genen op mRNA- of proteïnenivo te fereaskjen.
Mei-inoar markearje de boppesteande gegevens de komplekse en tiidsôfhinklike regeling fan mitochondriale morfology en de útdagings om dizze meganismen te ferdúdlikjen. Om genekspresje te bestudearjen, is it earst needsaaklik om spesifike doelgenen yn it paad te identifisearjen. Us gegevens litte lykwols sjen dat genen yn itselde paad net op deselde manier reagearje op deselde stress. Eins hawwe eardere stúdzjes oantoand dat ferskate genen yn itselde paad ferskillende tydlike responsprofilen kinne sjen litte30,46. Derneist binne d'r komplekse post-transkripsjonele meganismen dy't de relaasje tusken transkripsje en genfunksje fersteure. Proteomyske stúdzjes kinne ynsjoch jaan yn 'e ynfloed fan PTM's en proteïnefunksje, mar se stelle ek útdagings foar, ynklusyf metoaden mei lege trochput, hege signaal-rûsferhâldingen en minne resolúsje.
Yn dizze kontekst hat it bestudearjen fan mitochondriale morfology mei help fan TEM en MEL in grut potinsjeel om fûnemintele fragen te beantwurdzjen oer de relaasje tusken mitochondriale dynamyk en funksje en hoe't dit sykte beynfloedet. It wichtichste is dat TEM in direkte metoade biedt foar it mjitten fan mitochondriale morfology as in konvergint einpunt fan mitochondriale dysfunksje en dynamyk51. MEL biedt ek in direkte metoade foar it visualisearjen fan fisy- en fúzje-eveneminten yn in trijediminsjonale sellulêre omjouwing, wêrtroch kwantifikaasje fan dynamyske mitochondriale remodeling mooglik is, sels yn 'e ôfwêzigens fan feroaringen yn genekspresje33. Hjir markearje wy it nut fan mitochondriale ôfbyldingstechniken by sekundêre mitochondriale sykten. Dizze sykten wurde typysk karakterisearre troch groanyske milde metabolike stress karakterisearre troch subtile remodeling fan mitochondriale netwurken ynstee fan akute mitochondriale skea. De mitochondriale kompensaasje dy't nedich is om mitose ûnder groanyske stress te behâlden, hat lykwols djipgeande funksjonele gefolgen. Yn 'e kontekst fan neurowittenskip kin in better begryp fan dizze kompensaasjemeganismen wichtige ynformaasje leverje oer de pleiotropyske neuropatology dy't ferbûn is mei mitochondriale dysfunksje.
Uteinlik markearje ús gegevens it nut fan ôfbyldingstechniken foar it begripen fan 'e funksjonele gefolgen fan' e komplekse ynteraksjes tusken genekspresje, proteïnemodifikaasjes en proteïneaktiviteit dy't neuronale mitochondriale dynamyk kontrolearje. Wy brûkten PPA om mitochondriale dysfunksje te modellearjen yn in neuronaal selmodel om ynsjoch te krijen yn 'e mitochondriale komponint fan ASD. SH-SY5Y-sellen behannele mei PPA lieten feroarings sjen yn mitochondriale morfology: mitochondria waarden lyts en rûn, en cristae wiene min definieare doe't se waarden waarnommen troch TEM. MEL-analyze lit sjen dat dizze feroarings tagelyk foarkomme mei in tanimming fan fisje- en fúzje-eveneminten om it mitochondriale netwurk te behâlden yn reaksje op milde metabolike stress. Boppedat fersteurt PPA de transkripsjonele regeling fan mitochondriale metabolisme en homeostase signifikant. Wy identifisearren cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 as wichtige mitochondriale regulators dy't fersteurd wurde troch PPA-stress en kinne in rol spylje by it bemiddeljen fan PPA-induzearre feroarings yn mitochondriale morfology en funksje. Takomstige stúdzjes binne nedich om PPA-induzearre tydlike feroarings yn genekspresje en proteïneaktiviteit, lokalisaasje en post-translasjonele modifikaasjes better te karakterisearjen. Us gegevens markearje de kompleksiteit en ûnderlinge ôfhinklikens fan 'e regeljouwingsmeganismen dy't de mitochondriale stressreaksje bemiddelje en demonstrearje it nut fan TEM en oare ôfbyldingstechniken foar mear rjochte mechanistyske stúdzjes.
De SH-SY5Y-selline (ECACC, 94030304-1VL) waard kocht fan Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-sellen waarden groeid yn Dulbecco's modifisearre Eagle's medium/F-12 fiedingsstoffenmingsel (DMEM/F-12) en L-glutamine (SC09411, ScienCell) yn 25 cm2-flessen oanfolle mei 20% fetaal bovine serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) en 1% penisilline-streptomycine (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) by 37 °C, 5% CO2. Sellen waarden subkultivearre oant 80% konfluinsje mei 0,05% trypsine-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), sintrifugearre by 300 g en útplaat mei in tichtheid fan sawat 7 × 105 sellen/ml. Alle eksperiminten waarden útfierd op ûndifferinsjearre SH-SY5Y-sellen tusken passaazjes 19–22. PPA wurdt administreare as NaP. Los NaP-poeier (CAS-nûmer 137-40-6, gemyske formule C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) op yn waarm MilliQ-wetter oant in konsintraasje fan 1 M en bewarje by 4 °C. Verdun dizze oplossing op 'e dei fan behanneling mei 1 M PPA oant 3 mM en 5 mM PPA yn serumfrij medium (DMEM/F-12 mei L-glutamine). Behannelingskonsintraasjes foar alle eksperiminten wiene gjin PPA (0 mM, kontrôle), 3 mM, en 5 mM PPA. Eksperiminten waarden útfierd yn teminsten trije biologyske replikaten.
SH-SY5Y-sellen waarden siedde yn 25 cm5-flessen mei in snelheid fan 5,5 × 105 sellen/ml en 24 oeren groeid. De PPA-behanneling waard tafoege oan 'e flesse foar 24 oeren ynkubaasje. Sammelje selpellets neffens normale protokollen foar subkultuer fan sûchdierweefsel (hjirboppe beskreaun). Resuspendearje de selpellet yn 100 µl 2,5% glutaraldehyde, 1 × PBS en bewarje by 4 °C oant ferwurking. SH-SY5Y-sellen waarden koart sintrifugearre om de sellen te pelletearjen en 2,5% glutaraldehyde, 1 × PBS-oplossing te ferwiderjen. Resuspendearje it sedimint yn in 4% agarosegel taret yn destillearre wetter (de ferhâlding fan agarose ta sedimintfolume is 1:1). Agarose-stikken waarden pleatst op roosters op platte platen en bedekt mei 1-hexadeceen foar it befriezen ûnder hege druk. De samples waarden 24 oeren beferzen yn 100% droege aceton by -90 °C. De temperatuer waard doe ferhege nei -80 °C en in oplossing fan 1% osmiumtetroxide en 0,1% glutaraldehyde waard tafoege. De samples waarden 24 oeren by -80 °C opslein. Dêrnei waard de temperatuer stadichoan ferhege nei keamertemperatuer oer ferskate dagen: fan -80 °C oant -50 °C foar 24 oeren, nei -30 °C foar 24 oeren, nei -10 °C foar 24 oeren en úteinlik nei keamertemperatuer.
Nei kryogene tarieding waarden de samples impregnearre mei hars en waarden ultradunne seksjes (∼100 nm) makke mei in Leica Reichert UltracutS ultramikrotoom (Leica Microsystems). De seksjes waarden kleurd mei 2% uranylacetaat en leadcitraat. De samples waarden waarnommen mei in FEI Tecnai 20 transmissie-elektronenmikroskoop (ThermoFisher (earder FEI), Eindhoven, Nederlân) dy't wurke op 200 kV (Lab6-transmitter) en in Gatan CCD-kamera (Gatan, UK) foarsjoen fan in Tridiem-enerzjyfilter.
Yn elke technyske replikaasje waarden teminsten 24 ôfbyldings fan ien sel krigen, foar in totaal fan 266 ôfbyldings. Alle ôfbyldings waarden analysearre mei de Region of Interest (ROI) makro en de Mitochondria makro. De mitochondriale makro is basearre op publisearre metoaden17,31,32 en makket semi-automatisearre batchferwurking fan TEM-ôfbyldings yn Fiji/ImageJ69 mooglik. Koartsein: de ôfbylding wurdt omkeard en omkeard mei help fan rôljende bal-eftergrûnsubtraksje (radius fan 60 piksels) en in FFT-bandpassfilter (mei respektivelik boppeste en ûnderste grinzen fan 60 en 8 piksels) en fertikale line-ûnderdrukking mei in oriïntaasjetolerânsje fan 5%. De ferwurke ôfbylding wurdt automatysk drompeld mei in algoritme foar maksimale entropie en in binêr masker wurdt generearre. Ofbyldingsregio's dy't ferbûn binne mei mei de hân selektearre ROI's yn rau TEM-ôfbyldings waarden ekstrahearre, wêrby't mitochondria karakterisearre waarden en it plasmamembraan en oare regio's mei hege kontrast waarden útsletten. Foar elke ekstrahearre ROI waarden binêre dieltsjes grutter as 600 piksels analysearre, en dieltsjegebiet, perimeter, grutte en lytse assen, Feret-diameter, rûnens en sirkelfoarmigens waarden metten mei de ynboude mjitfunksjes fan Fiji/ImageJ. Neffens Merrill, Flippo en Strack (2017) waarden gebiet 2, dieltsjeaspektferhâlding (grutte- oant lytse-asferhâlding) en foarmfaktor (FF) berekkene út dizze gegevens, wêrby't FF = perimeter 2/4pi x gebiet. De definysje fan 'e parametryske formule is te finen yn Merrill, Flippo en Strack (2017). De neamde makro's binne beskikber op GitHub (sjoch Data Availability Statement). Gemiddeld waarden sawat 5.600 dieltsjes analysearre per PPA-behanneling, foar in totaal fan sawat 17.000 dieltsjes (gegevens net werjûn).
SH-SH5Y-sellen waarden pleatst yn 8-keamer kultuerskûtels (ThermoFisher, #155411) om adhesion oernacht mooglik te meitsjen en doe ynkubearre mei TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) en Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Ferven. Ofbyldings waarden krigen mei 405 nm en 561 nm lasers oer in omjouwing fan 10 minuten, en rûge ôfbyldings waarden krigen as z-stacks mei 10 ôfbyldingsmikrografyen mei in az-stap fan 0.2 μm tusken ôfbyldingsframes op 12 opienfolgjende tiidpunten. Ofbyldings waarden sammele mei in Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super-resolúsje platfoarm (Carl Zeiss, Oberkochen, Dútslân) mei in LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens. Ofbyldings waarden analysearre yn ImageJ mei in earder beskreaune pipeline en de ImageJ-plugin om fúzje- en fissie-eveneminten, it gemiddelde oantal mitochondriale struktueren en it gemiddelde mitochondriale folume per sel te mjitten33. MEL-makro's binne beskikber op GitHub (sjoch Data Availability Statement).
SH-SY5Y-sellen waarden 24 oeren foar de behanneling groeid yn platen mei seis putten mei in tichtheid fan 0,3 × 106 sellen/ml. RNA waard ekstrahearre mei it Quick-RNA™ Miniprep-protokol (ZR R1055, Zymo Research) mei lytse oanpassingen: foegje 300 μl RNA-lysisbuffer ta oan elke put foar it fuortheljen en lysearje elke stekproef as lêste stap mei 30 μl DNase/RNase-eluasjefrij wetter. Alle stekproeven waarden kontrolearre op kwantiteit en kwaliteit mei in NanoDrop ND-1000 UV-Vis-spektrofotometer. Totaal proteïne út sellysaten waard krigen mei 200 μl RIPA-lysisbuffer, en de proteïnekonsintraasje waard kwantifisearre mei de Bradford-proteïne-assay70.
cDNA-synteze waard útfierd mei de Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant mei wat oanpassingen. cDNA waard synthetisearre yn reaksjes fan 20 μl mei 0,7 oant 1 μg totaal RNA. Primers waarden selektearre út earder publisearre artikels 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) en begeliedende probes waarden ûntworpen mei de PrimerQuest-tool fan Integrated DNA Technologies. Alle genen fan belang waarden normalisearre nei it nukleêre B2M-gen. De genekspresje fan STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC en OPA1 waard metten mei RT-qPCR. De mastermix omfette LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM foarút- en efterútprimers, cDNA, en PCR-klasse wetter om in einfolume fan 10 μL foar elke reaksje te krijen. Ekspresje fan dielings- en fisygenen (DRP1, MFN1/2) waard metten mei TaqMan multiplex-assays. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) waard brûkt neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant mei lytse oanpassingen. De multiplex RT-qPCR mastermix omfettet 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM foarút- en efterútprimers, 10 μM probe, cDNA, en PCR-klasse wetter, wat resultearre yn in einfolume fan 20 μL foar elke reaksje. RT-qPCR waard útfierd mei Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - serienûmer: R0618110). Syklyske omstannichheden wurde werjûn yn tabel S1. Alle cDNA-samples waarden yn triplikaat amplifisearre en in standertkromme waard generearre mei in searje tsienfâldige ferdunningen. Utsjitters yn triplikaatsamples mei in syklusdrompelstandertôfwiking (Ct) > 0,5 waarden út 'e analyze helle om de reprodusearberens fan gegevens te garandearjen30,72. Relative genekspresje waard berekkene mei de 2-ΔΔCt79-metoade.
Proteïnemonsters (60 μg) waarden mingd mei Laemmli-laadbuffer yn in ferhâlding fan 2:1 en útfierd op in 12% kleurleaze proteïnegel (Bio-Rad #1610184). Proteïnen waarden oerdroegen nei in PVDF (polyvinylideenfluoride) membraan (#170-84156, Bio-Rad) mei it Trans-Blot Turbo-systeem (#170-4155, Bio-Rad). It membraan waard blokkearre en ynkubearre mei de passende primêre antistoffen (OPA1, MFN1, MFN2, en DRP1) (ferdund 1:1000) foar 48 oeren, folge troch ynkubaasje mei sekundêre antistoffen (1:10.000) foar 1 oere. Membranen waarden doe ôfbylde mei Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) en opnommen mei in Bio-Rad ChemiDoc MP-systeem. ImageLab ferzje 6.1 waard brûkt foar Western blot-analyze. De orizjinele gel en blot wurde werjûn yn figuer S1. Ynformaasje oer antistoffen wurdt jûn yn tabel S2.
Datasets wurde presintearre as it gemiddelde en de standertflater fan it gemiddelde (SEM) fan teminsten trije ûnôfhinklike stekproeven. Datasets waarden hifke op normaliteit mei de Shapiro-Wilks-test (útsein as oars oanjûn) foardat in Gaussyske ferdieling en gelikense standertôfwikingen oannommen waarden en de analyses útfierd waarden. Neist it analysearjen fan de dataset mei Fisher's MEL LSD (p < 0.05), ienwegs ANOVA (behanneling vs. kontrôlegemiddelde), en Dunnett's mearfâldige fergelikingstest om signifikânsje te bepalen (p < 0.05). Signifikante p-wearden wurde yn 'e grafyk werjûn as *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Alle statistyske analyses en grafyken waarden útfierd en generearre mei GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-makro's foar TEM-ôfbyldingsanalyse binne iepenbier beskikber op GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. De Mitochondrial Event Locator (MEL)-makro is iepenbier beskikber op GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM en Vijaya A. Mitochondria: masterregulators fan metabolisme, homeostase, stress, ferâldering en epigenetika. Yndonesysk. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Meardere fasettearre mitochondriale dysfunksje by skizofreny, kompleks I as in mooglik patologysk doelwyt. Skizofreny. boarne. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. en Beal, MF Mitochondriale dysfunksje by de sykte fan Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG en Mehta V. Stressearre mitochondria: doelen fan ynvaazje by de sykte fan Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF en Ferreira GK Mitochondria en it brein: bioenergetyk en mear. Neurotoxinen. boarne. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropyske mitochondria: de ynfloed fan mitochondria op neuronale ûntwikkeling en sykte. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. en Morais, VA Mitochondriale biogenese yn neuronen: hoe en wêr. ynternasjonaliteit. J. Mohr. de wittenskip. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. en Zhao, J. Regeling fan mitochondriale dynamyk by sûchdieren: kânsen en útdagings. front. endokrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. en Slack, RS Mitochondriale dynamyk yn 'e regeling fan neurogenese: fan it ûntwikkeljende oant folwoeksen harsens. ûntwikkeling. dynamyk. 247, 47–53 (2018).