Oanwêzich *Aktueel adres: Keulen 50931, Dútslân, Keulen Excellence Cluster Undersyk nei sellulêre stressrespons by ferâlderingsrelatearre sykten (CECAD).
De neurodegeneraasje fan mitochondriale sykten wurdt beskôge as ûnomkearber, om't de metabolike plastisiteit fan neuronen beheind is, mar it effekt fan mitochondriale dysfunksje op 'e selautonomy fan neuronale metabolisme yn it lichem wurdt min begrepen. Hjir yntrodusearje wy it selspesifike proteoom fan Purkinje-neuronen mei progressive OXPHOS-tekoart feroarsake troch fersteurde mitochondriale fúzjedynamika. Wy fûnen dat mitochondriale dysfunksje in djipgeande feroaring feroarsake op it mêd fan proteomika, wat úteinlik late ta de opienfolgjende aktivearring fan krekte metabolike programma's foar seldea. Unferwachts hawwe wy de dúdlike ynduksje fan pyruvaatkarboksylase (PCx) en oare anti-aging-enzymen bepaald dy't de tuskenprodukten fan 'e TCA-syklus oanfolje. Remming fan PCx fergrutte oksidative stress en neurodegeneraasje, wat oanjout dat atherosklerose in beskermjend effekt hat yn neuronen dy't OXPHOS misse. De restauraasje fan mitochondriale fúzje yn terminaal degenerearre neuronen keart dizze metabolike skaaimerken folslein om, wêrtroch seldea foarkomt. Us befiningen identifisearje earder ûnbekende paden dy't fearkrêft jaan oan mitochondriale dysfunksje en litte sjen dat neurodegeneraasje sels yn 'e lette stadia fan' e sykte omkeard wurde kin.
De sintrale rol fan mitochondria yn it behâld fan neuronale enerzjymetabolisme wurdt beklamme troch de wiidweidige neurologyske symptomen dy't ferbûn binne mei minsklike mitochondriale sykten. De measte fan dizze sykten wurde feroarsake troch genmutaasjes dy't mitochondriale genekspresje regelje (1, 2) of genferneatiging relatearre oan mitochondriale dynamyk, dy't yndirekt ynfloed hawwe op 'e stabiliteit fan mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). Wurk yn diermodellen hat oantoand dat yn reaksje op mitochondriale dysfunksje yn omlizzende weefsels konservative metabolike paden (5-7) aktivearre wurde kinne, wat wichtige ynformaasje leveret foar in djipgeand begryp fan 'e patogenese fan dizze komplekse sykten. Yn skril kontrast is ús begryp fan 'e metabolike feroarings fan spesifike seltypen feroarsake troch it algemiene falen fan mitochondriale adenosinetrifosfaat (ATP) produksje yn 'e harsens essensjeel (8), wat de needsaak beklammet om terapeutyske doelen te identifisearjen dy't brûkt wurde kinne om sykte te foarkommen of te foarkommen. Foarkom neurodegeneraasje (9). It gebrek oan ynformaasje is it feit dat senuwsellen breed beskôge wurde as heul beheinde metabolike fleksibiliteit yn ferliking mei de seltypen fan omlizzende weefsels (10). Mei it each op it feit dat dizze sellen in sintrale rol spylje by it koördinearjen fan 'e oanfier fan metaboliten oan neuronen om synaptyske oerdracht te befoarderjen en te reagearjen op ferwûnings en sykteomstannichheden, is it fermogen om selmetabolisme oan te passen oan 'e útdaagjende omstannichheden fan harsensweefsel hast beheind ta gliale sellen (11-14). Derneist hinderet de ynherinte sellulêre heterogeniteit fan harsensweefsel foar in grut part de stúdzje fan metabolike feroarings dy't foarkomme yn spesifike neuronale subgroepen. As gefolch is der net folle bekend oer de krekte sellulêre en metabolike gefolgen fan mitochondriale dysfunksje yn neuronen.
Om de metabolike gefolgen fan mitochondriale dysfunksje te begripen, hawwe wy Purkinje-neuronen (PN's) isolearre yn ferskate stadia fan neurodegeneraasje feroarsake troch de ferneatiging fan mitochondriale bûtenste membraanfúzje (Mfn2). Hoewol Mfn2-mutaasjes by minsken assosjeare binne mei in foarm fan erflike motoryske sensoryske neuropaty bekend as Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), is de betingste ferneatiging fan Mfn2 by mûzen in bekende ynduksje fan oksidaasjefosforylaasje (OXPHOS) dysfunksjemetoade. De ferskate neuronale subtypen (16-19) en it resultearjende neurodegenerative fenotype wurde begelaat troch progressive neurologyske symptomen, lykas bewegingssteurnissen (18, 19) of cerebellêre ataksie (16). Troch gebrûk te meitsjen fan in kombinaasje fan labelfrije kwantitative (LFQ) proteomika, metabolomika, ôfbylding en virologyske metoaden, litte wy sjen dat progressive neurodegeneraasje sterk pyruvaatkarboksylase (PCx) en oare faktoaren ynducearret dy't belutsen binne by arteriosklerose fan PN's yn vivo De ekspresje fan enzymen. Om de relevânsje fan dizze fynst te ferifiearjen, hawwe wy spesifyk de ekspresje fan PCx yn Mfn2-tekoartkommingen (PN's) delregulearre, en fûn dat dizze operaasje oksidative stress fergrutte en neurodegeneraasje fersnelde, wat bewiist dat azoospermia seldea en metabolike oanpassingsfermogen jout. Swiere ekspresje fan MFN2 kin de terminale degenerative PN mei swiere OXPHOS-tekoartkomming, massive konsumpsje fan mitochondriaal DNA, en skynber brutsen mitochondriaal netwurk folslein rêde, wat fierder beklammet dat dizze foarm fan neurodegeneraasje sels yn it avansearre stadium fan 'e sykte foar seldea herstelle kin.
Om de mitochondria yn Mfn2 knockout PN's te visualisearjen, hawwe wy in mûsstam brûkt dy't Cre-ôfhinklike mitochondria mooglik makket om giele fluoreszinte proteïne (YFP) (mtYFP) (20) Cre-ekspresje te rjochtsjen en de mitochondriale morfology yn vivo kontrolearre. Wy fûnen dat de ferneatiging fan it Mfn2-gen yn PN's soe liede ta de stadige dieling fan it mitochondriale netwurk (figuer S1A), en de ierste feroaring waard fûn op 3 wiken leeftyd. Yn tsjinstelling, de substansjele degeneraasje fan 'e PN-sellaach, lykas bliken docht út it ferlies fan Calbindin-immunokleuring, begon pas op 12 wiken leeftyd (figuer 1, A en B). De tiidsferskil tusken de ierste feroarings yn mitochondriale morfology en it sichtbere begjin fan neuronale dea soarge derfoar dat wy de metabolike feroarings ûndersochten dy't feroarsake waarden troch mitochondriale dysfunksje foar seldea. Wy hawwe in fluoreszinsje-aktivearre selsortearring (FACS)-basearre strategy ûntwikkele om YFP (YFP+)-ekspressearjende PN te isolearjen (figuer 1C), en yn kontrôlemûzen (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hjirnei oantsjutten as CTRL (figuer S1B). De optimalisaasje fan 'e gatingstrategy basearre op' e relative yntensiteit fan it YFP-sinjaal lit ús it YFP+ lichem (YFPhigh) fan PN's suverje fan net-PN's (YFPneg) (figuer S1B) of fertochte fluoreszinte axon/dendrityske fragminten (YFPlow; figuer S1D, lofts), befêstige troch in konfokale mikroskoop (figuer S1D, rjochts). Om de identiteit fan 'e klassifisearre populaasje te ferifiearjen, hawwe wy LFQ-proteomika en doe haadkomponintanalyse útfierd, en fûn dat der in dúdlike skieding is tusken YFPhigh- en YFPneg-sellen (figuer S1C). YFPhigh-sellen lieten in netto ferriking sjen fan bekende PN-markers (d.w.s. Calb1, Pcp2, Grid2 en Itpr3) (21, 22), mar gjin ferriking fan proteïnen dy't gewoanlik útdrukt wurde yn neuronen of oare seltypen (figuer 1D)). In ferliking tusken samples yn klassifisearre YFPhigh-sellen sammele yn ûnôfhinklike eksperiminten liet in korrelaasjekoëffisjint fan > 0.9 sjen, wat in goede reprodusearberens tusken biologyske replikaten oantoande (figuer S1E). Gearfetsjend validearren dizze gegevens ús plan foar akute en spesifike isolaasje fan mooglike PN. Omdat it brûkte L7-cre-stjoerprogramma mozaïekrekombinaasje ynducearret yn 'e earste wike nei de befalling (23), begûnen wy mûzen út te sluten fan CTRL en betingste (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neuronen te sammeljen. Nei't rekombinaasje foltôge is, wurdt it Mfn2cKO neamd op 4 wiken leeftyd. As einpunt hawwe wy in leeftyd fan 8 wiken keazen doe't de PN-laach yntakt wie nettsjinsteande de dúdlike mitochondriale fragmintaasje (figuer 1B en figuer S1A). Yn totaal hawwe wy yn totaal 3013 proteïnen kwantifisearre, wêrfan sawat 22% basearre wiene op MitoCarta 2.0-annotaasjes basearre op it mitochondriale proteoom as mitochondria (figuer 1E) (figuer 1E) (24). De differinsjele genekspresje-analyze útfierd yn wike 8 liet sjen dat mar 10,5% fan alle proteïnen wichtige feroarings hienen (figuer 1F en figuer S1F), wêrfan 195 proteïnen delregulearre wiene en 120 proteïnen omheechregulearre wiene (figuer 1F). It is it neamen wurdich dat de "ynnovative paadanalyse" fan dizze dataset sjen lit dat de ferskillend útdrukte genen benammen hearre ta in beheinde set spesifike metabolike paden (figuer 1G). Nijsgjirrich is dat, hoewol de delregulearring fan paden relatearre oan OXPHOS en kalsiumsinjalearring de ynduksje fan mitochondriale dysfunksje yn fúzje-defisjinte PN's befêstiget, oare kategoryen dy't benammen aminosoermetabolisme omfetsje, signifikant opregulearre binne, wat yn oerienstimming is mei it metabolisme dat foarkomt yn mitochondriale PN's. Rebedrading is konsekwint.
(A) Represintative konfokale foto's fan cerebellêre seksjes fan CTRL- en Mfn2cKO-mûzen dy't progresyf ferlies fan PN's sjen litte (calbindine, griis); kearnen waarden tsjinkleurd mei DAPI. (B) Kwantifikaasje fan (A) (ienrjochtingsfariânsje-analyze, ***P<0.001; n = 4 oant 6 sirkels fan trije mûzen). (C) Eksperimintele workflow. (D) Waarmtekaartferdieling fan markers spesifyk foar Purkinje (boppe) en oare seltypen (midden). (E) Venn-diagram dat it oantal mitochondriale proteïnen sjen lit dat identifisearre is yn 'e klassifisearre PN. (F) Fulkaanplot fan ferskillend útdrukte proteïnen yn Mfn2cKO-neuronen nei 8 wiken (signifikante cut-off wearde fan 1.3). (G) De kreativiteitspaadanalyse lit de fiif wichtichste opregulearrings- (reade) en delregulearrings- (blauwe) paden sjen yn 'e Mfn2cKO PN klassifisearre as 8 wiken. It gemiddelde ekspresjenivo fan elk detektearre proteïne wurdt werjûn. Griisskaalwaarmtekaart: oanpaste P-wearde. ns, net wichtich.
Proteomika-gegevens lieten sjen dat de proteïne-ekspresje fan kompleksen I, III en IV stadichoan ôfnaam. Kompleksen I, III en IV befette allegear essensjele mtDNA-kodearre sub-ienheden, wylst kompleks II, dat allinich kearnkodearre wie, yn prinsipe net beynfloede waard (figuer 2A en figuer S2A). Yn oerienstimming mei de proteomika-resultaten liet immunohistochemy fan serebellêre weefselseksjes sjen dat it MTCO1 (mitochondriale cytochrome C oxidase subunit 1) subunitnivo fan kompleks IV yn PN stadichoan ôfnaam (figuer 2B). De mtDNA-kodearre subunit Mtatp8 waard signifikant fermindere (figuer S2A), wylst it steady-state nivo fan 'e kearnkodearre ATP-synthase-subunit net feroare bleau, wat oerienkomt mei it bekende stabile ATP-synthase-subarem F1-kompleks as mtDNA-ekspresje stabyl is. De formaasje is konsekwint. Underbrekking (7). Evaluaasje fan it mtDNA-nivo yn 'e sortearre Mfn2cKO PN's troch real-time polymerasekettingreaksje (qPCR) befêstige de stadige ôfname yn it oantal mtDNA-kopyen. Yn ferliking mei de kontrôlegroep, op 8 wiken leeftyd, waard mar sawat 20% fan it mtDNA-nivo bewarre (figuer 2C). Yn oerienstimming mei dizze resultaten waard de konfokale mikroskopiekleuring fan Mfn2cKO PN's brûkt om DNA te detektearjen, wat de tiidsôfhinklike konsumpsje fan mitochondriale nukleotiden sjen lit (figuer 2D). Wy fûnen dat allinich guon kandidaten belutsen by mitochondriale proteïnedegradaasje en stressreaksje omheech regele wiene, ynklusyf Lonp1, Afg3l2 en Clpx, en OXPHOS-kompleksassemblagefaktoaren. Gjin wichtige feroaringen yn 'e nivo's fan proteïnen belutsen by apoptose waarden ûntdutsen (figuer S2B). Op deselde wize fûnen wy dat de mitochondria en endoplasmatysk reticulumkanalen belutsen by kalsiumtransport allinich lytse feroaringen hawwe (figuer S2C). Derneist fûn de evaluaasje fan autofagy-relatearre proteïnen gjin wichtige feroarings, wat oerienkomt mei de sichtbere ynduksje fan autofagosomen dy't yn vivo waarnommen is troch immunohistochemy en elektronenmikroskopie (figuer S3). De progressive OXPHOS-dysfunksje yn PN's giet lykwols mank mei dúdlike ultrastrukturele mitochondriale feroarings. Mitochondriale klusters kinne sjoen wurde yn 'e sellichems en dendrityske beammen fan Mfn2cKO PN's fan 5 en 8 wiken âld, en de binnenste membraanstruktuer hat djipgeande feroarings ûndergien (figuer S4, A en B). Yn oerienstimming mei dizze ultrastrukturele feroarings en in wichtige ôfname yn mtDNA, liet analyze fan akute serebrale cerebellêre plakjes mei tetramethylrhodamine methylester (TMRM) sjen dat it mitochondriale membraanpotinsjeel yn Mfn2cKO PN's signifikant fermindere wie (figuer S4C).
(A) Tiidsferrinanalyse fan it ekspresjenivo fan it OXPHOS-kompleks. Beskôgje allinich proteïnen mei P<0.05 nei 8 wiken (twa-wei ANOVA). Stippele line: Gjin oanpassing yn ferliking mei CTRL. (B) Links: In foarbyld fan in cerebellêre seksje markearre mei anti-MTCO1-antistof (skaalbalke, 20 μm). It gebiet beset troch Purkinje-sellichems is bedekt mei giel. Rjochts: Kwantifikaasje fan MTCO1-nivo's (ien-wei fariânsjeanalyse; n = 7 oant 20 sellen analysearre fan trije mûzen). (C) qPCR-analyse fan mtDNA-kopienûmer yn 'e sortearre PN (ien-wei fariânsjeanalyse; n = 3 oant 7 mûzen). (D) Links: In foarbyld fan in cerebellêre plak markearre mei in anti-DNA-antistof (skaalbalke, 20 μm). It gebiet beset troch Purkinje-sellichems is bedekt mei giel. Rjochts: Kwantifikaasje fan mtDNA-laesjes (ien-wei fariânsjeanalyse; n = 5 oant 9 sellen fan trije mûzen). (E) In foarbyld fan in akute cerebellêre seksje dy't mitoYFP + Purkinje-sellen (pylk) sjen lit yn in patchclamp-opname fan in hiele sel. (F) Kwantifikaasje fan 'e IV-kromme. (G) Represintative opnames fan depolarisearjende stroomynjeksje yn CTRL- en Mfn2cKO Purkinje-sellen. Boppeste spoar: De earste puls dy't AP triggerde. Underste spoar: Maksimale AP-frekwinsje. (H) Kwantifikaasje fan postsynaptyske spontane ynputs (sPSP's). De represintative opnamespoar en syn zoomferhâlding wurde werjûn yn (I). Ienrjochtingsfariânsje-analyze analysearre n = 5 oant 20 sellen fan trije mûzen. Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Represintative spoaren fan spontane AP opnommen mei de perforearre patchclamp-modus. Boppeste spoar: Maksimale AP-frekwinsje. Underste spoar: zoom fan in inkele AP. (K) Kwantifisearje de gemiddelde en maksimale AP-frekwinsje neffens (J). Mann-Whitney-test; n = 5 sellen waarden analysearre fan fjouwer mûzen. Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM; net wichtich.
Dúdlike OXPHOS-skea waard ûntdutsen yn 'e 8 wiken âlde Mfn2cKO PN, wat oanjout dat de fysiologyske funksje fan neuroanen slim abnormaal is. Dêrom hawwe wy de passive elektryske skaaimerken fan OXPHOS-tekoart neuroanen analysearre op 4 oant 5 wiken en 7 oant 8 wiken troch it útfieren fan patch-clamp-opnames fan hiele sellen yn akute cerebellêre plakjes (figuer 2E). Unferwachts wiene de gemiddelde rêstmembraanpotinsjeel en ynfierresistinsje fan Mfn2cKO-neuronen fergelykber mei de kontrôle, hoewol d'r subtile ferskillen wiene tusken sellen (Tabel 1). Op deselde wize waarden op 4 oant 5 wiken leeftyd gjin wichtige feroaringen yn 'e stroom-spanningsrelaasje (IV-kromme) fûn (figuer 2F). Lykwols oerlibben gjin Mfn2cKO-neuronen fan 7 oant 8 wiken âld it IV-regime (hyperpolarisaasjestap), wat oanjout dat d'r in dúdlike gefoelichheid is foar hyperpolarisaasjepotinsjeel yn dit lette stadium. Yn tsjinstelling, yn Mfn2cKO-neuronen, wurde de depolarisearjende streamingen dy't repetitive aksjepotinsjeel (AP) ûntladingen feroarsaakje goed tolerearre, wat oanjout dat har algemiene ûntladingspatroanen net signifikant ferskille fan dy fan 8 wiken âlde kontrôleneuronen (Tabel 1 en Figuer 2G). Op deselde wize wiene de frekwinsje en amplitude fan spontane postsynaptyske streamingen (sPSC's) te fergelykjen mei dy fan 'e kontrôlegroep, en de frekwinsje fan eveneminten naam ta fan 4 wiken nei 5 wiken nei 7 wiken nei 8 wiken mei in ferlykbere tanimming (Figuer 2, H en I). De perioade fan synaptyske ryping yn PN's (25). Ferlykbere resultaten waarden krigen nei perforearre PN's-patches. Dizze konfiguraasje foarkomt de mooglike kompensaasje fan sellulêre ATP-defekten, lykas kin barre by patch-clamp-opname fan hiele sellen. Yn it bysûnder waarden de rêstmembraanpotinsjeel en spontane ûntsjitfrekwinsje fan Mfn2cKO-neuronen net beynfloede (Figuer 2, J en K). Gearfetsjend jouwe dizze resultaten oan dat PN's mei dúdlike OXPHOS-dysfunksje goed omgean kinne mei hege-frekwinsje-ûntladingspatroanen, wat oanjout dat der in kompensaasjemeganisme is dat har mooglik makket om hast normale elektrofysiologyske reaksjes te behâlden.
Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM (ienrjochtingsfariânsje-analyze, Holm-Sidak's mearfâldige fergelikingstest; *P<0.05). It ienheidsnûmer wurdt oanjûn troch heakjes.
Wy hawwe ûndersocht oft ien fan 'e kategoryen yn 'e proteomics-dataset (figuer 1G) paden befettet dy't swiere OXPHOS-tekoart kinne tsjingean, en dêrmei útlizze wêrom't troffen PN hast normale elektrofysiology kin behâlde (figuer 2, E oant K). Proteomics-analyze liet sjen dat de enzymen dy't belutsen binne by it katabolisme fan fertakke aminosoeren (BCAA) signifikant omheech regele waarden (figuer 3A en figuer S5A), en it einprodukt acetyl-CoA (CoA) of succinyl CoA kin de tricarboxylaten oanfolje yn 'e arteriosklerose-soer (TCA)-syklus. Wy fûnen dat de ynhâld fan BCAA-transaminase 1 (BCAT1) en BCAT2 beide tanommen. Se katalysearje de earste stap fan BCAA-katabolisme troch glutamaat te generearjen út α-ketoglutaraat (26). Alle sub-ienheden dy't it fertakke keten keto acid dehydrogenase (BCKD) kompleks foarmje, binne opregulearre (it kompleks katalysearret de neifolgjende en ûnomkearbere dekarboksylaasje fan it resultearjende BCAA koalstofskelet) (Ofbylding 3A en Ofbylding S5A). Lykwols waarden gjin dúdlike feroarings yn BCAA sels fûn yn 'e sortearre PN, wat mooglik te tankjen is oan 'e ferhege sellulêre opname fan dizze essensjele aminosoeren of it gebrûk fan oare boarnen (glukose of molksûr) om de TCA-syklus oan te foljen (Ofbylding S5B). PN's sûnder OXPHOS lieten ek ferhege glutamine-ûntbining en transaminaasjeaktiviteiten sjen op 8 wiken leeftyd, wat kin wurde wjerspegele troch de opregulearring fan 'e mitochondriale enzymen glutaminase (GLS) en glutamine pyruvaat transaminase 2 (GPT2) (Ofbylding 3, A en C). It is it neamen wurdich dat de opregulearring fan GLS beheind is ta it spliced ​​​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (de feroaring fan Mfn2cKO/CTRL is sawat 4,5-fâld, P = 0,05), en syn spesifike opregulearring yn kankerweefsels kin mitochondriale bio-enerzjy stypje. (27).
(A) De waarmtekaart lit de feroaring yn proteïnenivo sjen foar de oantsjutte rûte nei 8 wiken. (B) Foarbyld fan in cerebellêre plak markearre mei anti-PCx-antistof (skaalbalke, 20 μm). De giele pylk wiist nei it Purkinje-sellichem. (C) Tiidsferrin proteïne-ekspresje-analyze identifisearre as in wichtige kandidaat foar atherosklerose (meardere t-test, *FDR <5%; n = 3-5 mûzen). (D) Boppe: In skematysk diagram dat de ferskate manieren sjen lit om de markearre koalstof yn 'e [1-13C]pyruvaat-tracer yn te gean (d.w.s. fia PDH of transarteriële rûte). Under: De fioelekaart lit it persintaazje fan ien-markearre koalstof (M1) sjen dat omset is yn asparaginezuur, sitroensoer en appelsoer nei it markearjen fan akute cerebellêre plakjes mei [1-13C]pyruvaat (paired t-test; ** P <0.01). (E) Wiidweidige tiidshistoarje-analyze fan it oanjûne paad. Beskôgje allinich proteïnen mei P<0.05 nei 8 wiken. Stippele line: gjin oanpassingswearde (twa-wei fariânsje-analyze; * P <0.05; *** P <0.001). Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM.
Yn ús analyze is BCAA-katabolisme ien fan 'e wichtichste opregulearringspaden wurden. Dit feit suggerearret sterk dat it fentilaasjevolume dat de TCA-syklus yngiet, feroare kin wêze yn PN sûnder OXPHOS. Dit kin in wichtige foarm fan neuronale metabolike rewiring fertsjintwurdigje, dy't in direkte ynfloed kin hawwe op neuronale fysiology en oerlibjen tidens it ûnderhâld fan slimme OXPHOS-dysfunksje. Yn oerienstimming mei dizze hypoteze fûnen wy dat it wichtichste anty-aterosklerotyske enzyme PCx opregulearre is (Mfn2cKO/CTRL feroaret sawat 1,5 kear; Figuer 3A), wat de konverzje fan pyruvaat nei oksaloasetaat katalysearret (28), dat nei alle gedachten yn harsensweefsel sit. De ekspresje yn is beheind ta astrocyten (29, 30). Yn oerienstimming mei de proteomika-resultaten liet konfokale mikroskopie sjen dat PCx-ekspresje spesifyk en signifikant ferhege wie yn OXPHOS-tekoart PN's, wylst PCx-reaktiviteit benammen beheind wie ta de oanbuorjende Bergmann gliale sellen fan 'e kontrôle (Figuer 3B). Om de waarnommen opregulearring fan PCx funksjoneel te testen, hawwe wy akute cerebellêre plakjes behannele mei [1-13C]pyruvaattracer. Doe't pyruvaat oksidearre waard troch pyruvaatdehydrogenase (PDH), ferdwûn syn isotooplabel, mar wurdt opnommen yn 'e TCA-syklustuskenprodukten as pyruvaat metabolisearre wurdt troch fasskulêre reaksjes (Ofbylding 3D). Ta stipe fan ús proteomikagegevens hawwe wy in grut oantal markers fan dizze tracer waarnommen yn it asparaginezuur fan Mfn2cKO-plakjes, wylst sitroensoer en appelsoer ek in matige trend hienen, hoewol net signifikant (Ofbylding 3D).
Yn 'e dopamine-neuronen fan MitoPark-mûzen mei mitochondriale dysfunksje feroarsake troch dopamine-neuronen dy't spesifyk it mitochondriale transkripsjefaktor A-gen (Tfam) ferneatigje (figuer S6B), wie PCx-ekspresje ek signifikant omheechregulearre (31), wat oanjout dat acetonsoer arteriosklerose It foarkommen fan 'e sykte wurdt regele tidens de dysfunksje fan neuronale OXPHOS yn it lichem. It is it neamen wurdich dat fûn is dat unike enzymen (32-34) dy't útdrukt wurde kinne yn neuronen dy't assosjeare wurde kinne mei arteriosklerose signifikant omheechregulearre binne yn PN's dy't OXPHOS ûntbrekke, lykas propionyl-CoA-karboksylase (PCC-A), Malonyl-CoA konvertearret propionyl-CoA nei succinyl-CoA en mitochondriaal malysk enzym 3 (ME3), waans wichtichste rol is om pyruvaat út malaat te herstellen (figuer 3, A en C) (33, 35). Derneist fûnen wy in wichtige tanimming fan it Pdk3-enzym, dat fosforylearret en sa PDH ynaktivearret (36), wylst gjin feroarings waarden waarnommen yn it Pdp1-enzym dat PDH aktivearret of it PDH-enzymkompleks sels (figuer 3A). Konsekwint, yn Mern2cKO PN's, waard de fosforylaasje fan 'e α1-subeenheid α (PDHE1α) subeenheid fan 'e pyruvaatdehydrogenase E1-komponint fan it PDH-kompleks yn Ser293 (bekend om de enzymaktiviteit fan PDH te remmen) fersterke (figuer S6C) (figuer S6C). Pyruvaat hat gjin fasskulêre tagong.
Uteinlik hawwe wy fûn dat it superpaad fan serine- en glycine-biosynteze, de relatearre mitochondriale folaat (1C)-syklus en proline-biosynteze (figuer 1G en figuer S5C) allegear signifikant opregulearre binne, neffens rapporten, tidens it aktivearringsproses. De omlizzende weefsels wurde aktivearre mei mitochondriale dysfunksje (5-7). Konfokale analyze dy't dizze proteomika-gegevens stipet, liet sjen dat yn PN mei OXPHOS ûntbrekkende, cerebellêre plakjes fan 8 wiken âlde mûzen ûnderwurpen waarden oan serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), in kaai-enzyme fan 'e mitochondriale folaatsyklus. Signifikante ymmúnreaksje (figuer S5D). Yn 13 CU-glukose-ynkubearre akute cerebellêre plakjes befêstigen metabolike tracing-eksperiminten fierder de opregulearring fan serine- en proline-biosynteze, wat oanjout dat de stream fan koalstofisoformen yn serine en proline tanommen is (figuer S5E). Om't de reaksjes befoardere troch GLS en GPT2 ferantwurdlik binne foar de synteze fan glutamaat út glutamine en de transaminaasje tusken glutamaat en α-ketoglutaraat, jout har opregulearring oan dat OXPHOS-tekoart oan neuroanen in ferhege fraach nei glutamaat hawwe. Dit kin rjochte wêze op it behâld fan 'e ferhege biosynteze fan proline (figuer S5C). Yn tsjinstelling ta dizze feroarings liet in proteomyske analyze fan cerebellêre astrocyten fan PN-spesifike Mfn2cKO-mûzen sjen dat dizze paden (ynklusyf alle antiperoxidasen) net signifikant feroaren yn ekspresje, wat oantoant dat dizze metabolike omlieding selektyf is foar degradearre PN (figuer S6, D oant G).
Gearfetsjend lieten dizze analyses signifikant ferskillende patroanen fan tydlike aktivearring fan spesifike metabolike paden yn PN's sjen. Hoewol abnormale neuronale mitochondriale funksje kin liede ta iere atherosklerose en 1C-remodeling (figuer 3E en figuer S5C), en sels foarsisbere feroarings yn 'e ekspresje fan I- en IV-kompleksen, binne de feroarings yn serine de novo-synteze pas dúdlik yn 'e lette stadia. OXPHOS-dysfunksje (figuer 3E en figuer S5C). Dizze befiningen definiearje in sekwinsjeel proses wêryn't de stress-induzearre mitochondriale (1C-syklus) en cytoplasmatyske (serinebiosynteze) synergistysk reagearje mei de tanimming fan atherosklerose yn 'e TCA-syklus om neuronale metabolisme opnij te foarmjen.
8 wiken âlde OXPHOS-tekoart PN's kinne hege-frekwinsje eksitaasjeaktiviteit behâlde en wichtige metabolike werferbining ûndergean om te kompensearjen foar mitochondriale dysfunksje. Dizze ûntdekking bringt in nijsgjirrige mooglikheid op dat sels op dit stuit dizze sellen ek terapeutyske yntervinsje kinne ûntfange om neurodegeneraasje te fertrage of te foarkommen. Let. Wy hawwe dizze mooglikheid oplost troch twa ûnôfhinklike yntervinsjes. Yn 'e earste metoade hawwe wy in Cre-ôfhinklike adeno-assosjeare firus (AAV) vektor ûntworpen, sadat MFN2 selektyf útdrukt wurde kin yn OXPHOS-tekoart PN's yn vivo (Ofbylding S7A). De AAV dy't kodearret foar MFN2 en it fluoreszinte reportergen mCherry (Mfn2-AAV) waarden ferifiearre yn primêre neuronkulturen yn vitro, wat feroarsake dat MFN2 op in Cre-ôfhinklike manier útdrukt waard en de mitochondriale morfology rêde, wêrtroch neuromutaasje yn Mfn2cKO neuronen foarkommen waard (Ofbylding S7, B, D en E). Folgjende fierden wy yn vivo eksperiminten út om stereotaktysk 8 wiken âlde Mfn2-AAV oan 'e cerebellêre korteks fan Mfn2cKO- en kontrôlemûzen te leverjen, en analysearren wy 12 wiken âlde mûzen (figuer 4A). De behannele Mfn2cKO-mûzen stoaren (figuer 1, A en B) (16). Firale transduksje yn vivo resultearre yn selektive ekspresje fan PN yn guon cerebellêre sirkels (figuer S7, G en H). De ynjeksje fan 'e kontrôle AAV dy't allinich mCherry ekspressearre (Ctrl-AAV) hie gjin signifikant effekt op 'e mjitte fan neurodegeneraasje yn Mfn2cKO-bisten. Yn tsjinstelling, de analyze fan Mfn2cKO's transdusearre mei Mfn2-AAV liet in signifikant beskermjend effekt fan 'e PN-sellaach sjen (figuer 4, B en C). Yn it bysûnder liket de neurondichtheid hast net te ûnderskieden te wêzen fan 'e kontrôlebisten (figuer 4, B en C, en figuer S7, H en I). De ekspresje fan MFN1, mar net MFN2, is like effektyf yn it rêden fan neuronale dea (figuer 4C en figuer S7, C en F), wat oanjout dat de ekspresje fan ektopyske MFN1 it gebrek oan MFN2 effektyf kin oanfolje. Fierdere analyze op it ienige PN-nivo liet sjen dat Mfn2-AAV de ultrastruktuer fan mitochondria foar in grut part rêde, mtDNA-nivo's normalisearre, en de hege ekspresje fan 'e anti-angiogenese-marker PCx ​​​​omkearde (figuer 4, C oant E). Fisuele ynspeksje fan 'e rêden Mfn2cKO-mûzen yn in rêstende steat liet sjen dat har hâlding en motoryske symptomen (beweging S1 oant S3) ferbettere wiene. Konklúzjend litte dizze eksperiminten sjen dat fertrage werynfiering fan MFN2 yn PN's mei in slim tekoart oan OXPHOS genôch is om mtDNA-konsumpsje om te kearen en atherosklerose te indusearjen, wêrtroch axondegeneraasje en neuronale dea yn vivo foarkommen wurde.
(A) In skema dat it eksperimintele skema sjen lit foar it ynjeksjearjen fan AAV dy't kodearret foar MFN2 as de oanjûne metabolike paadwize aktivearre is. (B) Represintative konfokale ôfbyldings fan 12 wiken âlde cerebellêre plakjes transdusearre op 8 wiken yn Mfn2cKO-mûzen en markearre mei anti-Calbindin-antistof. Rjochts: Skalearring fan axonvezels. De skaal fan 'e axonzoom is 450 en 75 μm. (C) Links: Kwantifikaasje fan Purkinje-seltichtens yn 'e AAV-transduksjelus (AAV+) (ienrjochtingsfariânsjeanalyse; n = 3 mûzen). Rjochts: mtDNA-fokusanalyse yn transdusearre PN op wike 12 (ûnpare t-test; n = 6 sellen fan trije mûzen). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Represintative transmissie-elektronenmikrografen fan PN's fan Mfn2cKO-cerebellêre seksjes transdusearre mei de oanjûne firale fektoren. It rôze masker yllustrearret it gebiet dat beset wurdt troch dendriten, en it giele stippele fjouwerkant yllustrearret de zoom dy't oan 'e rjochterkant oanbean wurdt; n stiet foar de kearn. Skaalbalke, 1μm. (E) lit in foarbyld sjen fan PCx-kleuring yn PN transdusearre nei 12 wiken. Skaalbalke, 20μm. OE, oerekspresje; FC, foldferoaring.
Uteinlik hawwe wy it belang fan peroxidase-induzearre sel-oerlibjen ûndersocht yn PN's dy't OXPHOS-dysfunksje hawwe ûnderfûn. Wy generearren mCherry kodearjend foar AAV-shRNA (koarte hierspeld-RNA) spesifyk rjochte op mûs PCx mRNA (AAV-shPCx), en ynjeksjearren it firus of syn scrambled kontrôle (AAV-scr) yn it cerebellum fan Mfn2cKO-mûzen. De ynjeksje waard útfierd yn 'e fjirde wike fan leeftyd (figuer 5A) om effektive PCx-knockdown te berikken yn 'e perioade dat PCx-ekspresje tanommen (figuer 3C) en de PN-sellaach noch yntakt wie (figuer 1A). It is it neamen wurdich dat it delslaan fan PCx (figuer S8A) liedt ta in wichtige fersnelling fan PN-dea, dy't beheind is ta de ynfekteare ring (figuer 5, B en C). Om it meganisme fan 'e metabolike effekten feroarsake troch PCx-opregulearring te begripen, hawwe wy de redoksstatus fan PN's bestudearre nei PCx-knockdown en AAV-bemiddelde optyske biosensor Grx1-roGFP2 waarden tagelyk útdrukt (figuer S8, B oant D) om glutathion te evaluearjen. De relative feroaring fan peptide-redoxpotinsjeel (38). Dêrnei fierden wy twa-foton fluoreszinsjelibbenslange ôfbyldingsmikroskopie (FLIM) út yn akute harsensplakken fan 7 wiken âlde Mfn2cKO of kontrôle-nestgenoaten om potinsjele feroaringen yn cytoplasmatyske redoksstatus te detektearjen nei it ferifiearjen fan FLIM-omstannichheden (figuer S8, E oant G). De analyze liet in wichtige tanimming sjen yn 'e oksidaasjetastân fan in inkele Mfn2cKO PN's sûnder PCx-ekspresje, wat oars is as kontrôleneuronen of Mfn2cKO PN's dy't allinich scrambled shRNA ekspressearje (figuer 5, D en E). Doe't PCx-ekspresje nei ûnderen regele waard, naam it persintaazje Mfn2cKO PN's dy't in heech oksidearre steat sjen lieten mei mear as trije kear ta (Ofbylding 5E), wat oanjout dat PCx-opregulearring de redokskapasiteit fan degenerearre neuronen hanthavene.
(A) In skema dat it eksperimintele skema sjen lit foar it ynjeksjearjen fan AAV dy't kodearret foar shPCx as de oanjûne metabolike paadwize aktivearre is. (B) Represintative konfokale foto's fan 8 wiken âlde cerebellêre seksjes yn Mfn2cKO-mûzen transdusearre en markearre mei anti-calcineurine-antistof nei 4 wiken. Skaalbalke, 450 μm. (C) Kwantifikaasje fan Purkinje-seltichtens yn AAV-transdusearre lussen (ienrjochtingsfariânsje-analyze; n = 3 oant 4 mûzen). Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM; ***P < 0,001. (D) Represintative FLIM-ôfbylding lit de gemiddelde libbensdoer sjen fan 7 wiken âlde PN dy't glutathion redox-sensor Grx1-roGFP2 ekspressearret ûnder de oantsjutte eksperimintele omstannichheden. LUT (opslachtabel) ferhâlding: oerlibjenstiidsynterval (yn pikosekonden). Skaalbalke, 25 μm. (E) It histogram lit de ferdieling sjen fan Grx1-roGFP2 libbensduurwearden fan (D) (n=158 oant 368 sellen yn twa mûzen ûnder elke tastân). It sirkeldiagram boppe elk histogram lit it oantal sellen sjen mei signifikant langere (read, oksidearre) of koartere (blau, fermindere) libbensduurwearden, dy't mear as 1 SD fan 'e gemiddelde libbensduurwearde yn CTRL-AAV-scr binne. (F) It foarstelde model lit it beskermjende effekt sjen fan opregulearring fan neuronale PCx.
Al mei al litte de gegevens dy't wy hjir leverje sjen dat de werekspresje fan MFN2 avansearre PN mei slimme OXPHOS-tekoart, slimme mtDNA-útputting en ekstreem abnormale ista-like morfology folslein rêde kin, wêrtroch trochgeande foarútgong mooglik is, sels by avansearre sykten. Neurodegeneraasje leveret omkearber bewiis fan it stadium foar seldea. Dizze graad fan metabolike fleksibiliteit wurdt fierder beklamme troch it fermogen fan neuronen om atherosklerose te indusearjen (in werbedrading fan 'e TCA-syklus), wat PCx-ekspresje yn PN's sûnder OXPHOS remt en seldea fersterket, wêrtroch't in beskermjende rol spilet (Ofbylding 5F).
Yn dizze stúdzje hawwe wy bewiis levere dat de reaksje fan PN's op OXPHOS-dysfunksje is om stadichoan te konvergearjen nei TCA-syklus atherosklerose fia it differinsjaal aktivearringspaad aktivearre troch metabolike programma's. Wy hawwe de proteomyske analyze befêstige mei in protte komplementêre metoaden en iepenbiere dat as se útdage wurde troch slimme mitochondriale dysfunksje, neuroanen in earder ûnbekende foarm fan metabolike elastisiteit hawwe. Ta ús ferrassing markearret it heule rewiringproses net needsaaklik de terminale metabolike steat dy't neurodegeneraasje stadichoan en ûnomkearber begeliedt, mar ús gegevens suggerearje dat it in ûnderhâldsneuron kin foarmje, sels yn it stadium foar seldea. Funksjoneel kompensaasjemeganisme. Dizze fynst jout oan dat neuroanen in flinke mjitte fan metabolike plastisiteit yn it lichem hawwe. Dit feit bewiist dat de lettere werynfiering fan MFN2 de ekspresje fan wichtige metabolike markers kin omkeare en PN-degeneraasje foarkomme. Krektoarsom, it remt atherosklerose en fersnelt transseksueel senuwen.
Ien fan 'e meast fassinearjende befiningen yn ús ûndersyk is dat PN's dy't OXPHOS misse it metabolisme fan 'e TCA-syklus kinne feroarje troch enzymen op te regeljen dy't spesifyk arteriosklerose stimulearje. Metabolyske werrangskikking is in gewoan skaaimerk fan kankersellen, wêrfan guon ôfhinklik binne fan glutamine om tuskenprodukten fan 'e TCA-syklus oan te foljen om redusearjende ekwivalinten te produsearjen, dy't de respiratoire keten oandriuwe en de produksje fan lipide- en nukleotidbiosyntezefoarrinners ûnderhâlde (39, 40). In resinte stúdzje liet sjen dat yn perifeare weefsels dy't OXPHOS-dysfunksje ûnderfine, de werferbining fan glutamine/glutamaatmetabolisme ek in prominent skaaimerk is (5, 41), wêrby't de rjochting fan glutamine-yngong yn 'e TCA-syklus ôfhinklik is fan Fanwegen de earnst fan OXPHOS-blessuere (41). D'r is lykwols in gebrek oan dúdlik bewiis oer elke oerienkomst fan neuronale metabolike plastisiteit yn it lichem en de mooglike relevânsje dêrfan yn 'e syktekontekst. Yn in resinte in vitro-stúdzje waard oantoand dat primêre kortikale neuronen glutamaatpools mobilisearje foar neurotransmissie, wêrtroch oksidatyf metabolisme en atherosklerose ûnder metabolike stressomstannichheden befoardere wurde (42). It is it neamen wurdich dat ûnder de farmakologyske ynhibysje fan it TCA-syklus-enzyme succinaatdehydrogenase, pyruvaatkarboksylaasje nei alle gedachten de synteze fan oksaloasetaat yn kultivearre cerebellêre granuleneuronen behâldt (34). De fysiologyske relevânsje fan dizze meganismen foar harsensweefsel (wêr't nei alle gedachten atherosklerose benammen beheind is ta astrocyten) hat lykwols noch altyd wichtige fysiologyske betsjutting (43). Yn dit gefal litte ús gegevens sjen dat PN's dy't skansearre binne troch OXPHOS yn it lichem kinne wurde oerskeakele nei BCAA-ôfbraak en pyruvaatkarboksylaasje, dy't de twa wichtichste boarnen binne fan oanfolling fan TCA-pooltuskenprodukten. Hoewol de fertochte bydrage fan BCAA-katabolisme oan neuronale enerzjymetabolisme is foarsteld, neist de rol fan glutamaat en GABA foar neurotransmissie (44), is d'r noch gjin bewiis foar dizze meganismen yn vivo. Dêrom is it maklik te spekulearjen dat dysfunksjonele PN's automatysk kinne kompensearje foar de konsumpsje fan TCA-tuskenprodukten oandreaun troch it assimilaasjeproses troch it ferheegjen fan atherosklerose. Benammen kin opregulearring fan PCx nedich wêze om in ferhege fraach nei asparaginezuur te behâlden, wat suggerearre wurdt yn proliferearjende sellen mei mitochondriale dysfunksje (45). Us metabolomika-analyze liet lykwols gjin wichtige feroarings sjen yn it steady-state nivo fan asparaginezuur yn Mfn2cKO PN's (figuer S6A), wat wierskynlik it ferskillende metabolike gebrûk fan asparaginezuur reflektearret tusken proliferearjende sellen en post-mitoatyske neuronen. Hoewol it krekte meganisme fan PCx-opregulearring yn dysfunksjonele neuronen yn vivo noch karakterisearre wurde moat, hawwe wy oantoand dat dizze te betiid reagearjende reaksje in wichtige rol spilet by it behâlden fan 'e redoks-steat fan neuronen, wat oantoand waard yn FLIM-eksperiminten op cerebellaire plakjes. Benammen it foarkommen fan PN's fan it opregulearjen fan PCx kin liede ta in mear oksidearre steat en seldea fersnelle. De aktivearring fan BCAA-ôfbraak en de karboksylaasje fan pyruvaat binne gjin manieren om de perifeare weefsels fan mitochondriale dysfunksje te karakterisearjen (7). Dêrom lykje se in prioriteitsfunksje te wêzen fan OXPHOS-tekoartfolle neuronen, sels as se net it ienige skaaimerk binne, dat wichtich is foar neurodegeneraasje.
Cerebellêre sykte is in heterogeen type neurodegenerative sykte dy't him meastentiids manifestearret as ataksie en faak PN's beskeadiget (46). Dizze neuronpopulaasje is benammen kwetsber foar mitochondriale dysfunksje, om't har selektive degeneraasje by mûzen genôch is om in protte fan 'e motorsymptomen te reprodusearjen dy't minsklike spinocerebellêre ataksie karakterisearje (16, 47, 48). Neffens rapporten is in transgeen mûsmodel mei in mutantgen assosjeare mei minsklike spinocerebellêre ataksie en hat mitochondriale dysfunksje (49, 50), wat it belang beklammet fan it bestudearjen fan 'e gefolgen fan OXPHOS-tekoart yn PNPH. Dêrom is it benammen geskikt om dizze unike neuronpopulaasje effektyf te isolearjen en te bestudearjen. Mei't PN's lykwols tige gefoelich binne foar druk en in leech oandiel fan 'e heule cerebellêre selpopulaasje útmeitsje, is foar in protte omics-basearre stúdzjes selektive skieding fan har as heule sellen noch altyd in útdaagjend aspekt. Hoewol it hast ûnmooglik is om in absolute ôfwêzigens fan fersmoarging fan oare seltypen (benammen folwoeksen weefsels) te berikken, hawwe wy in effektive dissosiaasjestap kombineare mei FACS om in foldwaande oantal libbensfetbere neuronen te krijen foar downstream proteomics-analyze, en hawwe wy in frij hege proteïnedekking (sawat 3000 proteïnen) yn ferliking mei de besteande dataset fan it heule cerebellum (51). Troch de libbensfetberens fan heule sellen te behâlden, kinne wy ​​mei de metoade dy't wy hjir leverje net allinich de feroaringen yn 'e metabolike paden yn' e mitochondria kontrolearje, mar ek de feroaringen yn har cytoplasmatyske tsjinhingers, wat it gebrûk fan mitochondriale membraanlabels oanfollet om seltype De nije metoade foar it oantal mitochondria yn komplekse weefsels te ferriken (52, 53). De metoade dy't wy beskriuwe is net allinich relatearre oan 'e stúdzje fan Purkinje-sellen, mar kin maklik tapast wurde op elk type sel om metabolike feroaringen yn sike harsens oan te pakken, ynklusyf oare modellen fan mitochondriale dysfunksje.
Uteinlik hawwe wy in terapeutysk finster identifisearre tidens dit metabolike rerangskikkingsproses dat de wichtichste tekens fan sellulêre stress folslein omkeare kin en neuronale degeneraasje foarkomme kin. Dêrom kin it begripen fan 'e funksjonele ymplikaasjes fan' e hjir beskreaune rewiring fûnemintele ynsjoch jaan yn mooglike behannelingen foar it behâld fan neuronale leefberens tidens mitochondriale dysfunksje. Takomstich ûndersyk rjochte op it dissektearjen fan feroaringen yn enerzjymetabolisme yn oare harsensellentypen is nedich om de tapasberens fan dit prinsipe op oare neurologyske sykten folslein te iepenbierjen.
MitoPark-mûzen binne earder beskreaun (31). C57BL/6N-mûzen mei loxP-flankearjende Mfn2-genen binne earder beskreaun (18) en krúst mei L7-Cre-mûzen (23). De resultearjende dûbel heterozygote neiteam waarden doe krúst mei homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP-mûzen om Purkinje-spesifike gen-knockouts foar Mfn2 te generearjen (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Yn in subset fan paring waard it Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allel (stop-mtYFP) yntrodusearre fia ekstra krusingen (20). Alle bistprosedueres waarden útfierd yn oerienstimming mei Jeropeeske, nasjonale en ynstitúsjonele rjochtlinen en goedkard troch LandesamtfürNatur fan Umwelt en Verbraucherschutz, Noardryn-Westfalen, Dútslân. Dierwurk folget ek de rjochtlinen fan 'e European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Nei it anesthesearjen fan 'e servikale dislokaasje fan' e swangere frou, wurdt it mûzeembryo isolearre (E13). De korteks waard dissekearre yn Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) oanfolle mei 10 mM Hepes en trochjûn oan Dulbecco's Modified Eagle's Medium mei papaïne (20 U/ml) en cysteine ​​(1μg/ml). Ynkubearje it weefsel yn DMEM) en dissosiearje it troch enzymatyske spiisfertarring. Ml) by 37°C foar 20 minuten, en dan meganysk meald yn DMEM oanfolle mei 10% fetaal bovine serum. Sellen waarden siedde op glêzen dekglaasjes bedekt mei polylysine mei in tichtens fan 2×106 per 6 sm kultuerskûtel of mei in tichtens fan 0,5×105 sellen/cm2 foar ôfbyldingsanalyse. Nei 4 oeren waard it medium ferfongen troch Neurobasal serumfrij medium mei 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax. De neuronen waarden doe by 37 °C en 5% CO2 hâlden tidens it eksperimint, en ien kear yn 'e wike fiede. Om rekombinaasje yn vitro te indusearjen, waard 3 μl (kultuerskûtel mei 24 putten) of 0,5 μl (plaat mei 24 putten) fan 'e folgjende AAV9-firusfektor brûkt om neuronen op 'e twadde dei yn vitro te behanneljen: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalogusnûmer 105530-AAV9) en AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalogusnûmer 105545-AAV9).
Mûs Mfn1 en Mfn2 komplementêr DNA (krigen fan Addgene plasmide #23212 en #23213, respektivelik) binne markearre mei de V5-sekwinsje (GKPIPNPLLGLDST) oan 'e C-terminus, en binne fusearre mei mCherry yn frame fia de T2A-sekwinsje. Grx1-roGFP2 is in kado fan Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Troch it ferfangen fan 'e tdTomato-kassette mei konvinsjonele kloningsmetoaden, waard de kassette subklonearre yn 'e pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-rêchbonke (Addgene referinsjenûmer 28306) om pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 en pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-fektoren te generearjen. In ferlykbere strategy waard brûkt om de kontrôlefektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry te generearjen. Om de AAV-shPCx-konstrukt te generearjen, is in plasmide AAV-fektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA # 1]) nedich, dy't de DNA-sekwinsje befettet dy't kodearret foar it shRNA dat rjochte is op mûs PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Under de kontrôle fan 'e U6-promotor wurdt mCherry brûkt ûnder de kontrôle fan 'e CMV-promotor. De produksje fan help-AAV-fektoren waard útfierd neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant (Cell Biolabs). Koartsein, brûk in oerdrachtplasmide dat tydlik mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) draacht. Transfeksje fan 293AAV-sellen-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) of Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodearjend gen, lykas kodearjend AAV1-kapsideproteïne en accessoireproteïne. Ferpakkingsplasmideplasmide, mei de kalsiumfosfaatmetoade. De rûge firussupernatant waard krigen troch frieze-ûntdooi-syklusen yn in droech iis/ethanolbad en sellen lysearre yn fosfaatbufferde sâltwetter (PBS). De AAV-fektor waard suvere troch ûnderbrutsen iodixanolgradiëntultrasintrifugaasje (24 oeren by 32.000 rpm en 4 °C) en konsintrearre mei in Amicon ultra-15 sintrifugaalfilter. Genoomtiter fan AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 genoomkopy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX wie lykas earder beskreaun (54), metten troch real-time kwantitative PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) en AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primêre neuronen waarden ôfskraabd yn iiskâlde 1x PBS, yn pellets foarme, en doe homogenisearre yn 0.5% Triton X-100 / 0.5% natriumdeoxycholaat/PBS lysisbuffer mei fosfatase en protease-ynhibitor (Roche). Proteïnekwantifikaasje waard útfierd mei de bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). De proteïnen waarden doe skieden troch SDS-polyacrylamidegelelektroforese, en doe blotted op in polyvinylideenfluoridemembraan (GE Healthcare). Blokkearje net-spesifike plakken en ynkubearje mei de primêre antistof (sjoch tabel S1 foar details) yn 5% molke yn TBST (Tris-bufferde sâltwetter mei Tween), waskstappen en sekundêre antistof yn TBST Incubate. Ynkubearje mei primêre antistof oernachtich by +4 °C. Nei it waskjen, tapasse de sekundêre antistof foar 2 oeren by keamertemperatuer. Dêrnei, troch deselde blot te ynkubearjen mei in anti-β-actine antistof, waard deselde lading befêstige. Deteksje troch it omsetten nei chemiluminescence en it ferbetterjen fan chemiluminescence (GE Healthcare).
De neuronen dy't earder op glêzen dekglaasjes siedde wiene, waarden op it oantsjutte tiidpunt by keamertemperatuer foar 10 minuten fêstmakke mei 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS. De dekglaasjes wurde earst 5 minuten by keamertemperatuer trochdrenkt mei 0,1% Triton X-100/PBS, en dêrnei yn blokkearjende buffer [3% bovine serumalbumine (BSA)/PBS]. Op de twadde dei waarden de dekglaasjes wosken mei blokkearjende buffer en 2 oeren by keamertemperatuer ynkubearre mei it passende fluorofoor-konjugearre sekundêre antistof; úteinlik waarden de samples yngeand wosken yn PBS mei 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) tsjinkleurd en dêrnei fêstmakke op it mikroskoopglaasje mei Aqua-Poly/Mount.
Mûzen (manlik en wyfke) waarden anaesthesisearre troch intraperitoneale ynjeksje fan ketamine (130 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) en subkutaan administrearre mei carprofen-analgetikum (5 mg/kg), en pleatst yn in stereotaktysk ynstrumint (Kopf) foarsjoen fan in waarm kessen. Meitsje de skedel bleat en brûk in toskboar om it diel fan 'e cerebellêre korteks dat oerienkomt mei it mis-bonke te ferdunnen (fan lambda: sturt 1.8, lateraal 1, oerienkommende mei lobulen IV en V). Brûk in bûgde spuitnaald om foarsichtich in lyts gat yn 'e skedel te meitsjen om te foarkommen dat de ûndersteande vaskulatuer fersteurd wurdt. Dan wurdt de tinne lutsen glêzen kapillêr stadich yn it mikrogat ynfoege (fan -1.3 oant -1 oan 'e ventrale kant fan' e dura mater), en wurdt 200 oant 300 nl AAV ferskate kearen by lege druk yn 'e mikro-ynjektor (Narishige) ynjektearre mei hânmjittige spuiten (Narishige) oer in perioade fan 10 oant 20 minuten. Nei de ynfúzje, pleats de kapillêr noch 10 minuten om it firus folslein te fersprieden. Nei't de kapillêrren weromlutsen binne, wurdt de hûd foarsichtich hechte om wûneûntstekking te minimalisearjen en it bist te herstellen. De bisten waarden nei de operaasje ferskate dagen behannele mei pijnstillers (caspofen), wêryn't har fysike tastân sekuer kontrolearre waard en dêrnei waarden se op it oanjûne tiidpunt euthanasearre. Alle prosedueres waarden útfierd neffens Jeropeeske, nasjonale en ynstitúsjonele rjochtlinen en waarden goedkard troch LandesamtfürNatur fan Umwelt en Verbraucherschutz, Noardryn-Westfalen, Dútslân.
De bisten waarden anesthetisearre mei ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en it hert waard earst perfusearre mei 0.1 M PBS, en doe mei 4% PFA yn PBS. It weefsel waard dissekearre en oernachtich by 4°C fêstmakke yn 4% PFA/PBS. In triljend mes (Leica Microsystems GmbH, Wenen, Eastenryk) waard brûkt om sagittale seksjes (50 μm dik) fan 'e fêstmakke harsens yn PBS ta te rieden. Behalven as oars oanjûn, waard kleuring fan frij driuwende seksjes útfierd lykas hjirboppe beskreaun (13) by keamertemperatuer en roerjend. Koartsein, earst waarden de krigen plakjes permeabilisearre mei 0.5% Triton X-100/PBS foar 15 minuten by keamertemperatuer; foar guon epitopen (Pcx en Shmt2), troch yn tris-EDTA-buffer by 80°C (pH 9) de plakjes 25 minuten te ferwaarmjen ynstee fan dizze stap. Dêrnei waarden de seksjes ynkubearre mei primêre antistof (sjoch tabel S1) yn blokkearjende buffer (3% BSA/PBS) by 4 °C oernachtich ûnder roeren. De oare deis waarden de seksjes wosken mei blokkearjende buffer en 2 oeren by keamertemperatuer ynkubearre mei it passende fluorofoor-konjugearre sekundêre antistof; úteinlik waarden de seksjes goed wosken yn PBS, tsjinkleurd mei DAPI, en doe fêstmakke mei AquaPolymount op in mikroskoopglaasje.
In laser-scannende konfokale mikroskoop (TCS SP8-X of TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) foarsjoen fan in wyt ljochtlaser en in 405 diode ultraviolette laser waard brûkt om it stekproef ôf te byldzjen. Troch it oanspriuwen fan 'e fluorofoor en it sammeljen fan it sinjaal mei Hybrid Detector (HyDs), waard LAS-X-software brûkt om stapelde ôfbyldings te sammeljen dy't oerienkomme mei Nyquist-sampling yn sekwinsjele modus: foar net-kwantitative panielen binne it tige dynamyske sinjalen (bygelyks yn somatyske sellen en dendriten) mtYFP) Brûk HyD om it oantal PN's te detektearjen yn BrightR-modus). Gating fan 0,3 oant 6 ns wurdt tapast om eftergrûn te ferminderjen.
Real-time ôfbylding fan sortearre sellen. Nei it sortearjen yn Neurobasal-A medium mei 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax, waarden sellen fuortendaliks siedde op poly-l-lysine-coated glêzen objektglaasjes (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalogusnûmer 80826), en doe 1 oere by 37 °C en 5% CO2 hâlden om de sellen te litten delsetten. Real-time ôfbylding waard útfierd op in Leica SP8 laserscanning konfokale mikroskoop foarsjoen fan in wite laser, HyD, 63 × [1.4 numerike apertuer (NA)] oaljeobjektivlens en in ferwaarmingsstadium.
De mûs waard gau anaesthesearre mei koalstofdiokside en ûnthalze, de harsens waarden gau út 'e skedel helle, en yn sagittale seksje snien fan 200 μm dik (foar 13C-labelingseksperimint) of 275 μm dik (foar twa fotoneksperiminten) fol mei de folgjende materialen. It iis (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Dútslân) is fol mei de folgjende stoffen: 125 mM iiskâld, koalstof-ferzadigd (95% O2 en 5% CO2) leech Ca2 + keunstmjittige harsensfloeistof (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 0,5 mM CaCl2 en 3,5 mM MgCl2 (osmotyske druk fan 310 oant 330 mmol). Bring de krigen harsensplakjes oer nei in foar-ynkubaasjekeamer mei hegere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 en 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 en 310 oant 320 mmol).
Tidens it ôfbyldingsproses waarden de plakjes nei in tawijde ôfbyldingskeamer ferpleatst, en it eksperimint waard útfierd ûnder trochgeande ACSF-perfúzje by in konstante temperatuer fan 32° oant 33°C. In multifoton laser-scanningmikroskoop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) foarsjoen fan in Leica 25x objektivlens (NA 0.95, wetter), Ti: Sapphire-laser (Chameleon Vision II, Coherent) waard brûkt foar plakôfbylding. FLIM-module (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM fan Grx1-roGFP2. De feroarings yn 'e cytoplasmatyske redoks-tastân fan PN's waarden metten troch twa-foton FLIM yn sagittale harsensplakken, wêrby't de Grx1-roGFP2-biosensor PN's rjochte. Yn 'e PN-laach wurdt it akwisysjefjild selektearre sawat 50 oant 80 μm ûnder it plakoerflak om te soargjen dat der in libbensfetbere PN is (dat is, it ûntbrekken fan kralenstruktuer of neuronale morfologyske feroarings lâns de dendriten) en de dûbel positive roGFP2-sensor en AAV-kodearjende shRNA PCx of syn kontrôlesekwinsje (elk mei-ekspressearjend mCherry). Sammelje single-stack-ôfbyldings mei 2x digitale zoom [eksitaasjegolflingte: 890 nm; 512 nm 512 piksels]. Deteksje: ynterne HyD, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) filtergroep] en ôfbyldingsmiddeling binnen 2 oant 3 minuten wurde brûkt om te soargjen dat genôch fotonen wurde sammele (1000 fotonen yn totaal) foar krommepassing. De gefoelichheid fan 'e Grx1-roGFP2-sonde en de ferifikaasje fan FLIM-omstannichheden waarden útfierd troch de libbensduurwearde fan roGFP2 te kontrolearjen by it tafoegjen fan eksogene 10 mM H2O2 oan 'e perfúzje-ACSF (om oksidaasje te maksimalisearjen, wat resulteart yn in ferhege libbensduur), en dan it tafoegjen fan 2 mM dithiothreitol (minimalisearret de mjitte fan reduksje, wat resulteart yn in fermindering fan 'e libbensduur) (Ofbylding S8, D oant G). Brûk FLIMfit 5.1.1-software om de krigen resultaten te analysearjen, past de ienige eksponentiële ferfalkromme fan 'e heule ôfbylding oan' e mjitten IRF (ynstrumintresponsfunksje), en χ2 is sawat 1. Om de libbensduur fan in inkele PN te berekkenjen, waard it masker om it senuwlichem mei de hân tekene, en de gemiddelde libbensduur yn elk masker waard brûkt foar kwantifikaasje.
Mitochondriale potinsjeelanalyse. Nei't de akute seksje 30 minuten ynkubearre wie mei 100 nM TMRM direkt tafoege oan 'e perfusearre ACSF, waarden de mitochondriale potinsjeelferoaringen fan PN's metten mei in twa-fotonmikroskoop. TMRM-ôfbylding waard útfierd troch de sonde te stimulearjen by 920 nm en ynterne HyD (tetramethylrhodamine-isothiocyanaat: 585/40 nm) te brûken om sinjalen te sammeljen; troch deselde eksitaasjegolflingte te brûken, mar in oare ynterne HyD (FITC: 525/50) te brûken om mtYFP ôf te byldzjen. Brûk de ImageJ's Image Calculator-plug-in om mitochondriale potinsje op it nivo fan ien sel te evaluearjen. Koartsein, de plug-in-fergeliking: sinjaal = min (mtYFP, TMRM) wurdt brûkt om de mitochondriale regio te identifisearjen dy't it TMRM-sinjaal yn Purkinje Somali toant yn 'e single-stack konfokale ôfbylding fan it oerienkommende kanaal. Dan wurdt it pikselgebiet yn it resultearjende masker kwantifisearre, en dan normalisearre op 'e oerienkommende drompel single-stack ôfbylding fan it mtYFP-kanaal om de mitochondriale fraksje te krijen dy't it mitochondriale potinsjeel toant.
De ôfbylding waard dekonvoluearre mei Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Foar de skende ôfbyldings fan tegels wurdt de montage fan ien tegel makke mei it automatyske stikalgoritme levere troch LAS-X software. Nei ôfbyldingskalibraasje, brûk ImageJ en Adobe Photoshop om de ôfbylding fierder te ferwurkjen en de helderheid en it kontrast unifoarm oan te passen. Brûk Adobe Illustrator foar grafyske tarieding.
mtDNA-fokusanalyse. It oantal mtDNA-laesjes waard kwantifisearre op cerebellêre seksjes markearre mei antistoffen tsjin DNA mei in konfokale mikroskoop. Elk doelgebiet waard makke foar it sellichem en de kearn fan elke sel, en it respektive gebiet waard berekkene mei de Multi Measure-plug-in (ImageJ-software). Trek it kearngebiet ôf fan it sellichemgebiet om it cytoplasmatyske gebiet te krijen. Uteinlik waard de Analyze Particles-plug-in (ImageJ-software) brûkt om automatysk de cytoplasmatyske DNA-punten te kwantifisearjen dy't mtDNA oanjoegen op 'e drompelôfbylding, en de krigen resultaten waarden normalisearre nei it PN-gemiddelde fan CTRL-mûzen. De resultaten wurde útdrukt as it gemiddelde oantal nukleosiden per sel.
Proteïne-ekspresje-analyze. Brûk de Image Calculator-plugin fan ImageJ om proteïne-ekspresje yn PN op it nivo fan ien sel te evaluearjen. Koartsein, yn 'e ienlaachse konfokale ôfbylding fan it oerienkommende kanaal, fia de fergeliking: sinjaal = min (mtYFP, antistof), wurdt de mitochondriale regio dy't immunoreaktiviteit toant oan in bepaald antistof yn Purkina identifisearre. Dan wurdt it pikselgebiet yn it resultearjende masker kwantifisearre, en dan normalisearre op 'e oerienkommende drompelôfbylding fan it mtYFP-kanaal om de mitochondriale fraksje fan it werjûne proteïne te krijen.
Purkinje-seltichtensanalyse. De Cell Counter-plugin fan ImageJ waard brûkt om Purkinje-tichtens te evaluearjen troch it oantal teld Purkinje-sellen te dielen troch de lingte fan 'e cerebellêre ring dy't beset wurdt troch de teld sellen.
Tarieding en samling fan stekproeven. De harsens fan 'e kontrôlegroep en Mfn2cKO-mûzen waarden fiksearre yn 2% PFA/2,5% glutaraldehyde yn 0,1 M fosfaatbuffer (PB), en doe waarden koronale seksjes taret mei ciliaten (Leica Mikrosysteme GmbH, Wenen, Eastenryk) (Dikte 50 oant 60 μm). Dêrnei waarden se 1 oere by keamertemperatuer fiksearre yn PB-buffer yn 1% os-tetraoxide en 1,5% kaliumferrocyanide. De seksjes waarden trije kear wosken mei destillearre wetter, en doe 20 minuten kleurd mei 70% ethanol mei 1% uranylacetaat. De seksjes waarden doe dehydratisearre yn gradearre alkohol en ynbêde yn Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxyhars (Electron Microscopy Sciences, katalogusnûmer 14040) tusken silikon-coated glêzen objektglaasjes, en úteinlik by 60 °C 48 oeren yn 'e oven polymerisearre. It gebiet fan 'e cerebellêre korteks waard selektearre en 50 nm ultradunne seksjes waarden snien op Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wenen, Eastenryk) en plukt op in 2 × 1 mm koperen spleetraster bedekt mei polystyreenfilm. De seksjes waarden kleurd mei in oplossing fan 4% uranylacetaat yn H2O foar 10 minuten, ferskate kearen wosken mei H2O, doe mei Reynolds leadcitraat yn H2O foar 10 minuten, en doe ferskate kearen wosken mei H2O. Mikrofoto's waarden makke mei in transmissie-elektronenmikroskoop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Feriene Steaten) mei in TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitale kamera (TVIPS GmbH, Gauting, Feriene Steaten). Dútslân).
Foar mûzen ynfekteare mei AAV waarden de harsens skieden en yn in 1 mm dikke sagittale seksje snien, en it cerebellum waard ûndersocht mei in fluoreszinsjemikroskoop om de mei AAV ynfekteare ring te identifisearjen (dat is, mCherry-ekspresje). Allinnich eksperiminten wêryn AAV-ynjeksje resulteart yn in heul hege transduksje-effisjinsje fan 'e Purkinje-sellaach (d.w.s. hast de heule laach) yn teminsten twa opienfolgjende cerebellêre ringen wurde brûkt. De AAV-transdusearre lus waard mikrodissekearre foar oernacht nei fiksaasje (4% PFA en 2,5% glutaraldehyde yn 0,1 M kokoaatbuffer) en fierder ferwurke. Foar EPON-ynbêding waard it fêstmakke weefsel wosken mei 0,1 M natriumkokoaatbuffer (Applichem), en ynkubearre mei 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) yn 0,1 M natriumkokoaatbuffer (Applichem) 4 oeren, dan wosken foar 2 oeren. Werhelje 3 kear mei 0,1 M kokamidebuffer. Dêrnei waard de opkommende searje ethanol brûkt om elke ethanoloplossing 15 minuten by 4 °C te ynkubearjen om it weefsel te dehydratearjen. It weefsel waard oerdroegen nei propyleenokside en oernachtich ynkubearre yn EPON (Sigma-Aldrich) by 4 °C. Plak it weefsel 2 oeren yn farske EPON by keamertemperatuer, en ynbêde it dan 72 oeren by 62 °C. Brûk in ultramikrotoom (Leica Microsystems, UC6) en in diamantmes (Diatome, Biel, Switserlân) om ultradunne seksjes fan 70 nm te snijen, en kleurje mei 1,5% uranylacetaat foar 15 minuten by 37 °C, en kleurje mei leadcitraatoplossing 4 minuten. De elektronenmikrofoto's waarden makke mei in JEM-2100 Plus transmissie-elektronenmikroskoop (JEOL) foarsjoen fan Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) en DigitalMicrograph-software (Gatan). Foar analyze waarden elektronenmikrofoto's makke mei 5000× of 10.000× digitale zoom.
Morfologyske analyze fan mitochondria. Foar alle analyzes waarden de kontoeren fan yndividuele mitochondria manuell sketst yn digitale ôfbyldings mei help fan ImageJ-software. Ferskillende morfologyske parameters wurde analysearre. Mitochondriale tichtens wurdt útdrukt as in persintaazje krigen troch it totale mitochondriale gebiet fan elke sel te dielen troch it cytoplasma-gebiet (cytoplasma-gebiet = selgebiet-selkearngebiet) × 100. De rûnens fan mitochondria wurdt berekkene mei de formule [4π∙(gebiet/perimeter 2)]. De ista-morfology fan mitochondria waard analysearre en ferdield yn twa kategoryen ("buisfoarmich" en "blister") neffens har haadfoarmen.
Analyse fan oantal en tichtens fan autofagosomen/lysosomen. Brûk ImageJ-software om de kontoeren fan elke autofagosom/lysosoom yn 'e digitale ôfbylding manuell te sketsen. It oerflak fan 'e autofagosom/lysosoom wurdt útdrukt as in persintaazje berekkene troch it totale oerflak fan 'e autofagosom/lysosoomstruktuer fan elke sel te dielen troch it cytoplasma-gebiet (cytoplasma-gebiet = selgebiet-kearngebiet) × 100. De tichtens fan autofagosomen/lysosomen wurdt berekkene troch it totale oantal te dielen troch it oantal autofagosom-/lysosoomstrukturen per sel (yn termen fan cytoplasmatysk gebiet) (cytoplasmatysk gebiet = selgebiet-kearngebiet).
Labeling foar akute seksje en tarieding fan stekproeven. Foar eksperiminten dy't glukoselabeling fereaskje, oerdrage de akute harsensplakjes nei in pre-ynkubaasjekeamer, dy't verzadigde koalstof (95% O2 en 5% CO2), hege Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en 2.0 mM MgCl2, oanpast oan pH 7.4 en 310 oant 320 mOsm) befettet, wêryn glukose 13C6-glukose-substituasje is (Eurisotop, katalogusnûmer CLM-1396). Foar eksperiminten dy't pyruvaatlabeling fereaskje, oerdrage de akute harsensplakjes nei hegere Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 1.0 mM CaCl2 en foegje 2.0 mM MgCl2 ta, oanpasse oan pH 7.4 en 310 oant 320 mOsm), en foegje 1 mM 1-[1-13C]pyruvaat (Eurisotop, katalogusnûmer CLM-1082) ta. Ynkubearje de seksjes foar 90 minuten by 37°C. Oan 'e ein fan it eksperimint waarden de seksjes fluch wosken mei in wetterige oplossing (pH 7.4) mei 75 mM ammoniumkarbonaat, en dan homogenisearre yn 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): metanol: wetter. Nei't de seksjes 30 minuten op iis ynkubearre wiene, waarden de samples 10 minuten sintrifugearre by 21.000 g by 4 °C, en waard de dúdlike supernatant droege yn in SpeedVac-konsentrator. De resultearjende droege metabolietpellet waard opslein by -80 °C oant de analyze.
Floeistofchromatografy-massaspektrometry-analyze fan 13C-labelde aminosoeren. Foar floeistofchromatografy-massaspektrometry (LC-MS)-analyze waard de metabolietpellet opnij suspendearre yn 75μl wetter fan LC-MS-kwaliteit (Honeywell). Nei sintrifugaasje by 21.000 g foar 5 minuten by 4 °C waard 20 μl fan 'e klaarmakke supernatant brûkt foar aminosoerfluxanalyze, wylst de rest fan it ekstrakt fuortendaliks brûkt waard foar anionanalyze (sjoch hjirûnder). Aminosoeranalyze waard útfierd mei it earder beskreaune benzoylchloride-derivatisaasjeprotokol (55, 56). Yn 'e earste stap waard 10μl fan 100 mM natriumkarbonaat (Sigma-Aldrich) tafoege oan 20μl metabolietekstrakt, en doe waard 10μl fan 2% benzoylchloride (Sigma-Aldrich) tafoege oan 'e LC-kwaliteit ACN. It stekproef waard koart vortexed en doe sintrifugearre by 21.000 g foar 5 minuten by 20 °C. Oerdrage de skjinmakke supernatant nei in 2 ml autosampler-fleske mei in konyske glêzen ynfoegsel (200 μl folume). De stekproeven waarden analysearre mei it Acquity iClass ultra-hege prestaasjes LC-systeem (Waters) ferbûn mei de Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) hege-resolúsje presyzje massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Foar analyze waard 2 μl fan it derivatisearre stekproef ynjektearre yn in 100 × 1,0 mm hege-sterkte silika T3-kolom (Waters) mei 1,8 μm dieltsjes. De streamsnelheid is 100 μl/min, en it buffersysteem bestiet út buffer A (10 mM ammoniumformaat en 0,15% mierensoer yn wetter) en buffer B (ACN). De gradiënt is as folget: 0%B nei 0 minuten; 0%B. 0 oant 15% B op 0 oant 0,1 minuten; 15 oant 17% B op 0,1 oant 0,5 minuten; B op 17 oant 55% op 0,5 oant 14 minuten; B op 55 oant 70% op 14 oant 14,5 minuten; op 14,5 oant 70 oant 100% B op 18 minuten; 100% B op 18 oant 19 minuten; 100 oant 0% B op 19 oant 19,1 minuten; 0% B op 19,1 oant 28 minuten (55, 56). De QE-HF massaspektrometer wurket yn positive ionisaasjemodus mei in massaberik fan m/z (massa/ladingsferhâlding) fan 50 oant 750. De tapaste resolúsje is 60.000, en it krigen gain control (AGC) iondoel is 3 × 106, en de maksimale iontiid is 100 millisekonden. De ferwaarme elektrospray-ionisaasje (ESI) boarne wurket by in sprayspanning fan 3,5 kV, in kapillêre temperatuer fan 250 °C, in skedeluchtstream fan 60 AU (arbitrêre ienheden), en in helpluchtstream fan 20 AU. 250 °C. De S-lens is ynsteld op 60 AU.
Anionchromatografy-MS-analyze fan 13C-labelde organyske soeren. De oerbleaune metabolietpresipitaat (55μl) waard analysearre mei in Dionex-ionchromatografysysteem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ferbûn mei in QE-HF-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Koartsein, 5μl metabolietekstrakt waard ynjektearre yn in Dionex IonPac AS11-HC-kolom foarsjoen fan HPLC (2 mm × 250 mm, dieltsjegrutte 4μm, Thermo Fisher Scientific) yn push-in partielle loopmodus mei in folferhâlding fan 1.) Dionex IonPac AG11-HC-beskermingskolom (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). De kolomtemperatuer wurdt hâlden op 30 °C, en de autosampler wurdt ynsteld op 6 °C. Brûk in kaliumhydrokside-cartridge foarsjoen fan deionisearre wetter om in kaliumhydroksidegradiënt te generearjen fia de eluentgenerator. Skieding fan metaboliten mei in streamsnelheid fan 380 μl/min, mei de folgjende gradiënt: 0 oant 3 minuten, 10 mM KOH; 3 oant 12 minuten, 10 oant 50 mM KOH; 12 oant 19 minuten, 50 oant 100 mM KOH; 19 oant 21 minuten, 100 mM KOH; 21 oant 21,5 minuten, 100 oant 10 mM KOH. De kolom waard opnij yn lykwicht brocht ûnder 10 mM KOH foar 8,5 minuten.
De eluearre metaboliten wurde kombinearre mei in 150μl/min isopropanol-supplementstream nei de kolom en dan nei in hege-resolúsje massaspektrometer rjochte dy't wurket yn negative ionisaasjemodus. MS kontrolearret it massaberik fan m/z 50 oant 750 mei in resolúsje fan 60.000. De AGC is ynsteld op 1 × 106, en de maksimale iontiid wurdt hâlden op 100 ms. De ferwaarme ESI-boarne waard betsjinne op in sprayspanning fan 3,5 kV. De oare ynstellingen fan 'e ionboarne binne as folget: kapillêre temperatuer 275 °C; skedegasstream, 60 AU; helpgasstream, 20 AU by 300 °C, en S-lensynstelling op 60 AU.
Data-analyze fan 13C-labelde metaboliten. Brûk TraceFinder-software (ferzje 4.2, Thermo Fisher Scientific) foar data-analyze fan isotoopferhâlding. De identiteit fan elke ferbining waard ferifiearre troch in betroubere referinsjeferbining en ûnôfhinklik analysearre. Om isotoopferrikingsanalyse út te fieren, waard it gebiet fan it ekstrahearre ionchromatogram (XIC) fan elke 13C-isotoop (Mn) ekstrahearre út [M + H]+, wêrby't n it koalstofnûmer fan 'e doelferbining is, brûkt om aminosoeren te analysearjen of [MH]+ wurdt brûkt om anionen te analysearjen. De massa-krektens fan XIC is minder as fiif dielen per miljoen, en de krektens fan RT is 0,05 minuten. De ferrikingsanalyse wurdt útfierd troch de ferhâlding fan elke detektearre isotoop ta de som fan alle isotopen fan 'e oerienkommende ferbining te berekkenjen. Dizze ferhâldingen wurde jûn as persintaazjewearden foar elke isotoop, en de resultaten wurde útdrukt as molêr persintaazje ferriking (MPE), lykas earder beskreaun (42).
De beferzen neuronpellet waard homogenisearre yn iiskâlde 80% methanol (v/v), vortexed, en ynkubearre by -20°C foar 30 minuten. Vortex it monster nochris en roer by +4°C foar 30 minuten. It monster waard sintrifugearre by 21.000 g foar 5 minuten by 4°C, en doe waard de resultearjende supernatant sammele en droege mei in SpeedVac-konsentrator by 25°C foar lettere analyze. Lykas hjirboppe beskreaun, waard LC-MS-analyze útfierd op 'e aminosoeren fan' e sortearre sellen. Mei TraceFinder (ferzje 4.2, Thermo Fisher Scientific) waard gegevensanalyze útfierd mei de monoisotopyske massa fan elke ferbining. Kwantile normalisaasje fan metabolietgegevens waard útfierd mei it preprocessCore-softwarepakket (57).
Tarieding fan stikken. De mûs waard fluch anaesthesisearre mei koalstofdiokside en ûnthalze, de harsens waarden fluch út 'e skedel helle, en it mei iis folde trilmes (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Dútslân) waard brûkt om it yn sagittale seksjes fan 300 oant 375 μm te snijen. Kâlde koalstoffergassing (95% O2 en 5% CO2) Leech Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 en 6,0 mM MgCl2 Oanpasse oan pH 7,4 en 310 oant 330 mOsm). Bring de krigen harsensplakjes oer nei in keamer mei hegere Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriumfosfaatbuffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukose, 4.0 mM CaCl2 en mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 en 310 oant 320 mOsm). Bewarje de plakjes 20 oant 30 minuten, sadat se weromset wurde kinne foar it opnimmen.
opname. In mikroskooptafel foarsjoen fan in fêste opnamekeamer en in 20x wetterûnderdompelingsobjektivlens (Scientifica) waard brûkt foar alle opnames. De fertochte Purkinje-sellen waarden identifisearre troch (i) lichemsgrutte, (ii) anatomyske lokaasje fan it cerebellum, en (iii) ekspresje fan it fluoreszinte mtYFP-reportergen. De patchpipet mei in tipweerstand fan 5 oant 11 megohm wurdt útlutsen troch in borosilikaatglêskapillêr (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Dútslân) en in horizontale pipet Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Alle opnames waarden útfierd troch ELC-03XS npi patchklemfersterker (npi electronic GmbH, Tam, Dútslân), dy't waard regele troch de software Signal (ferzje 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). It eksperimint waard opnommen mei in samplingfrekwinsje fan 12,5 kHz. It sinjaal wurdt filtere mei twa koarte-pass Bessel-filters mei ôfsnijfrekwinsjes fan respektivelik 1.3 en 10 kHz. De kapasitânsje fan it membraan en de pipette wurdt kompensearre troch it kompensaasjesirkwy mei help fan de fersterker. Alle eksperiminten waarden útfierd ûnder kontrôle fan in Orca-Flash 4.0-kamera (Hamamatsu, Gerden, Dútslân), dy't kontrolearre waard troch de Hokawo-software (ferzje 2.8, Hamamatsu, Gerden, Dútslân).
Routine konfiguraasje en analyze fan hiele sellen. Folje de pipette direkt foar it opnimmen mei de ynterne oplossing dy't de folgjende stoffen befettet: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kaliumglukonaat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosinetrifosfaat (GTP) (Na) en 10.0 mM kreatininefosfaat waarden oanpast oan pH 7.25, en de osmotyske druk wie 290 mOsm (sukrose). Direkt nei it tapassen fan in krêft fan 0 pA om it membraan te brekken, waard de rêstmembraanpotinsjeel metten. De ynfierwjerstân wurdt metten troch it tapassen fan hyperpolarisearre streamingen fan -40, -30, -20 en -10 pA. Mjit de grutte fan 'e spanningsreaksje en brûk de wet fan Ohm om de ynfierwjerstân te berekkenjen. Spontane aktiviteit waard 5 minuten lang opnommen yn in spanningsklem, en sPSC waard identifisearre en metten yn Igor Pro (ferzje 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Feriene Steaten) mei in semi-automatysk werkenningsskript. De IV-kromme en steady-state stroom wurde metten troch de batterij op ferskate potinsjes te klemmen (begjinnend fan -110 mV) en de spanning yn stappen fan 5 mV te ferheegjen. De produksje fan AP waard hifke troch in depolarisearjende stroom ta te passen. Klem de sel op -70 mV wylst in depolarisearjende stroompuls tapast wurdt. Pas de stapgrutte fan elke opname-ienheid apart oan (10 oant 60 pA). Berekkene de maksimale AP-frekwinsje troch de pulspieken dy't de heechste AP-frekwinsje feroarsaakje, manuell te tellen. De AP-drompel wurdt analysearre mei de twadde ôflate fan 'e depolarisaasjepuls dy't earst ien of mear AP's triggert.
Perforearre patchkonfiguraasje en -analyse. Fier perforearre patchregistraasje út mei standertprotokollen. Brûk in ATP- en GTP-frije pipette dy't de folgjende yngrediïnten net befettet: 128 mM glukonaat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA en 2 mM MgCl2, en oanpasse oan pH 7.2 (mei KOH). ATP en GTP wurde weilitten út 'e intrasellulêre oplossing om ûnkontrolearre permeabiliteit fan it selmembraan te foarkommen. De patchpipet wurdt fol mei in amfoterisine-befettende ynterne oplossing (sawat 200 oant 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) om in ponsde patchregistraasje te krijen. Amfoterisine waard oplost yn dimethylsulfokside (eindkonsintraasje: 0.1 oant 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). De brûkte konsintraasje fan DMSO hie gjin signifikant effekt op 'e bestudearre neuronen. Tidens it ponsproses waard de kanaalwjerstân (Ra) kontinu kontroleare, en it eksperimint waard begûn nei't de amplitude fan Ra en AP stabilisearre wiene (20-40 minuten). Spontane aktiviteit wurdt metten yn in spannings- en/of stroomtang foar 2 oant 5 minuten. Data-analyze waard útfierd mei Igor Pro (ferzje 7.05.2, WaveMetrics, Feriene Steaten), Excel (ferzje 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Feriene Steaten) en GraphPad Prism (ferzje 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Feriene Steaten). Om spontane AP's te identifisearjen wurdt de NeuroMatic v3.0c plugin fan IgorPro brûkt. Identifisearje AP's automatysk mei in opjûne drompel, dy't yndividueel oanpast wurdt foar elke record. Mei help fan it spike-ynterval, bepale de spikefrekwinsje mei de maksimale direkte spikefrekwinsje en de gemiddelde spikefrekwinsje.
PN-isolaasje. Troch oan te passen oan it earder publisearre protokol, waarden PN's suvere út it mûs-cerebellum yn in spesifisearre stadium (58). Koartsein, it cerebellum waard dissekearre en fynhakke yn iiskâld dissosiaasjemedium [sûnder HBSS Ca2+ en Mg2+, oanfolle mei 20 mM glukoaze, penisilline (50 U/ml) en streptomycine (0,05 mg/ml)], en dan waard it medium fertarre yn papaïne [HBSS, oanfolle mei 1-cysteïne·HCl (1 mg/ml), papaïne (16 U/ml) en deoxyribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Behannelje 30 minuten by 30°C. Earst waskje de weefsels yn HBSS-medium mei aaislym (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) en DNase (0.1 mg/ml) by keamertemperatuer om enzymatyske spiisfertarring te foarkommen, en dan yn it HBSS-medium mei 20 mM glukoaze. Foarsichtich fermalen yn HBSS, penisilline (50 U/ml), streptomycine (0.05 mg/ml) en DNase (0.1 mg/ml) litte ienkele sellen frij. De resultearjende selsuspensje waard filtere troch in 70μm selfilter, doe waarden de sellen pelletearre troch sintrifugaasje (1110 rpm, 5 minuten, 4°C) en opnij suspendearre yn sortearmedium [HBSS, oanfolle mei 20 mM glukoaze, 20% fetaal bovine] serum, penisilline (50 U/ml) en streptomycine (0.05 mg/ml)]; evaluearje de sellibensfetberens mei propidiumjodide en oanpasse de seltichtens nei 1×106 oant 2×106 sellen/ml. Foar streamcytometry waard de suspensje filtere troch in 50 μm selfilter.
Flowcytometer. Selsortearring waard útfierd by 4°C mei in FACSAria III-masine (BD Biosciences) en FACSDiva-software (BD Biosciences, ferzje 8.0.1). De selsuspensje waard sortearre mei in 100 μm-nozzle ûnder in druk fan 20 psi mei in snelheid fan ~2800 eveneminten/sek. Om't tradisjonele gatingkritearia (selgrutte, bimodale ûnderskieding en ferspriedingskarakteristiken) de juste isolaasje fan PN fan oare seltypen net kinne garandearje, wurdt de gatingstrategy ynsteld op basis fan 'e direkte ferliking fan' e YFP-yntensiteit en autofluoreszinsje yn mitoYFP+ ​​​​en de kontrôle mitoYFP − mûzen. YFP wurdt oanstutsen troch it stekproef te bestralen mei in 488 nm laserline, en it sinjaal wurdt detektearre mei in 530/30 nm bandpassfilter. Yn mitoYFP+ ​​​​mûzen wurdt de relative sterkte fan it Rosa26-mitoYFP-reportergen ek brûkt om neuronale lichems- en axonfragminen te ûnderskieden. 7-AAD wurdt oanstutsen mei in giele laser fan 561 nm en detektearre mei in bandpassfilter fan 675/20 nm om deade sellen út te sluten. Om astrocyten tagelyk te skieden, waard de selsuspensje kleurd mei ACSA-2-APC, dêrnei waard it stekproef bestraald mei in laserline fan 640 nm, en waard in bandpassfilter fan 660/20 nm brûkt om it sinjaal te detektearjen.
De sammele sellen waarden yn pellets set troch sintrifugaasje (1110 rpm, 5 minuten, 4 °C) en opslein by -80 °C oant gebrûk. Mfn2cKO-mûzen en harren nestwelpen wurde op deselde dei klassifisearre om proseduerele fariabiliteit te minimalisearjen. FACS-gegevenspresintaasje en -analyze waarden útfierd mei FlowJo-software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Feriene Steaten).
Lykas hjirboppe neamd (59), wurdt real-time PCR brûkt om DNA te isolearjen fan 'e sortearre neuronen foar folgjende mtDNA-kwantifikaasje. De lineariteit en drompelgefoelichheid waarden yn earste ynstânsje hifke troch qPCR út te fieren op ferskillende oantallen sellen. Koartsein, sammelje 300 PN yn in lysisbuffer besteande út 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 en proteinase K (200 ng/ml) en ynkubearje by 55 °C 120 minuten. De sellen waarden fierder ynkubearre by 95 °C foar 10 minuten om folsleine ynaktivaasje fan proteinase K te garandearjen. Mei in TaqMan-sonde (Thermo Fisher) spesifyk foar mt-Nd1, waard mtDNA metten troch semi-kwantitative PCR yn it 7900HT Real-Time PCR-systeem (Thermo Fisher Scientific). Science, katalogusnûmer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalogusnûmer AIVI3E8) en 18S (Thermo Fisher Scientific, katalogusnûmer Hs99999901_s1) genen.
Tarieding fan proteoommonster. Troch de oplossing 10 minuten te ferwaarmjen by 95 °C en te sonisearjen, yn 'e lysisbuffer [6 M guanidinechloride, 10 mM tris(2-karboksyethyl)fosfinehydrochloride, 10 mM chloroacetamide en 100 mM tris-Lyse beferzen neuronpellets yn HCl]. Op Bioruptor (Diagenode) foar 10 minuten (30 sekonden puls / 30 sekonden pauzeperioade). It monster waard 1:10 ferdund yn 20 mM tris-HCl (pH 8.0), mingd mei 300 ng trypsingoud (Promega), en oernachtich ynkubearre by 37 °C om folsleine spiisfertarring te berikken. Op 'e twadde dei waard it monster 20 minuten sintrifugearre by 20.000 g. De supernatant waard ferdund mei 0,1% mierensoer, en de oplossing waard ûntsâlt mei selsmakke StageTips. It stekproef waard droege yn in SpeedVac-ynstrumint (Eppendorf-konsentrator plus 5305) by 45 °C, en doe waard it peptide suspendearre yn 0,1% mierensoer. Alle stekproeven waarden tagelyk troch deselde persoan taret. Om astrocyt-samples te analysearjen, waarden 4 μg ûntsâlte peptiden markearre mei in tandem-massa-tag (TMT10plex, katalogusnûmer 90110, Thermo Fisher Scientific) mei in ferhâlding fan peptide ta TMT-reagens fan 1:20. Foar TMT-labeling waard 0,8 mg TMT-reagens opnij suspendearre yn 70 μl wetterfrije ACN, en it droege peptide waard opnij gearstald yn 9 μl 0,1 M TEAB (triethylammoniumbikarbonaat), wêr't 7 μl TMT-reagens yn ACN oan tafoege waard. De konsintraasje wie 43,75%. Nei 60 minuten ynkubaasje waard de reaksje blust mei 2 μl 5% hydroxylamine. De markearre peptiden waarden sammele, droege, opnij suspendearre yn 200μl 0,1% mierensoer (FA), yn twaen ferdield, en doe ûntsâlt mei selsmakke StageTips. Mei help fan in UltiMate 3000 ultra hege prestaasjes floeistofchromatograaf (UltiMate 3000 ultra hege prestaasjes floeistofchromatograaf) waard ien fan 'e twa helten fraksjonearre op in 1 mm x 150 mm Acquity chromatografyske kolom fol mei 130 Å1,7 μm C18-dieltsjes (Waters, katalogusnr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Skied de peptiden mei in streamingssnelheid fan 30 μl/min, skied fan 1% oant 50% buffer B foar 85 minuten mei in stapsgewijze gradiënt fan 96 minuten, fan 50% oant 95% buffer B foar 3 minuten, dan 8 minuten foar 95% Buffer B; Buffer A is 5% ACN en 10 mM ammoniumbikarbonaat (ABC), en buffer B is 80% ACN en 10 mM ABC. Sammelje fraksjes elke 3 minuten en kombinearje se yn twa groepen (1 + 17, 2 + 18, ensfh.) en droegje se yn in fakuümsentrifuge.
LC-MS/MS-analyze. Foar massaspektrometry waarden de peptiden (nûmer r119.aq) skieden op in PicoFrit-analytyske kolom fan 25 sm en 75 μm mei in binnendiameter (nije objektivlens, ûnderdielnûmer PF7508250) foarsjoen fan 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), brûk EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Dútslân). De kolom waard op 50 °C hâlden. Buffers A en B binne respektivelik 0,1% mierensoer yn wetter en 0,1% mierensoer yn 80% ACN. Peptiden waarden skieden fan 6% nei 31% buffer B foar 65 minuten en fan 31% nei 50% buffer B foar 5 minuten mei in gradiënt fan 200 nl/min. De eluearre peptiden waarden analysearre op in Orbitrap Fusion-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Peptideprecursor m/z-mjitting wurdt útfierd mei in resolúsje fan 120.000 yn it berik fan 350 oant 1500 m/z. Mei 27% normalisearre botsingsenerzjy wurdt de sterkste precursor mei in ladingsstatus fan 2 oant 6 selektearre foar hege-enerzjy C-trapdissosiaasje (HCD) splitsing. De syklustiid is ynsteld op 1 s. De m/z-wearde fan it peptidefragment waard metten yn 'e ionentrap mei it lytste AGC-doel fan 5 × 104 en de maksimale ynjeksjetiid fan 86 ms. Nei fragmintaasje waard de precursor 45 s op 'e dynamyske útslutingslist pleatst. TMT-labelde peptiden waarden skieden op in 50 sm, 75 μm Acclaim PepMap-kolom (Thermo Fisher Scientific, katalogusnûmer 164942), en de migraasjespektra waarden analysearre op in Orbitrap Lumos Tribrid-massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) foarsjoen fan apparatuer foar hege-fjild asymmetryske golffoarmioanen (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) dy't wurket op twa kompensaasjespanningen fan −50 en −70 V. MS3 selektearre op basis fan 'e syngronisaasjefoarrinner wurdt brûkt foar TMT-rapport-ionsignaalmjitting. De peptideskieding waard útfierd op EASY-nLC 1200, mei in 90% lineêre gradiënteluasje, mei in bufferkonsintraasje fan 6% oant 31%; buffer A wie 0,1% FA, en buffer B wie 0,1% FA en 80% ACN. De analytyske kolom wurdt betsjinne by 50 °C. Brûk FreeStyle (ferzje 1.6, Thermo Fisher Scientific) om it orizjinele bestân te splitsen neffens de FAIMS-kompensaasjespanning.
Proteïne-identifikaasje en kwantifikaasje. Mei de yntegreare Andromeda-sykmasine waarden de orizjinele gegevens analysearre mei MaxQuant ferzje 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Neist de Cre-rekombinase- en YFP-sekwinsjes krigen fan Aequorea victoria, waarden peptidefragmentspektra trochsocht nei de kanonike sekwinsje en isoformsekwinsje fan it mûsreferinsjeproteoom (Proteome ID UP000000589, downloade fan UniProt yn maaie 2017). Methionine-oksidaasje en proteïne N-terminale acetylaasje waarden ynsteld as fariabele modifikaasjes; cysteine-carbamoylmetylaasje waard ynsteld as fêste modifikaasjes. De spiisfertarringsparameters binne ynsteld op "spesifisiteit" en "trypsine/P". It minimale oantal peptiden en razorpeptiden brûkt foar proteïne-identifikaasje is 1; it minimale oantal unike peptiden is 0. Under de betingsten fan peptidekaartmatching wie de proteïne-identifikaasjesnelheid 0.01. De opsje "Twadde peptide" is ynskeakele. Brûk de opsje "match between runs" om suksesfolle identifikaasjes oer te dragen tusken ferskate orizjinele bestannen. Brûk LFQ minimale ratio count 1 foar labelfrije kwantifikaasje (LFQ) (60). De LFQ-yntensiteit wurdt filtere foar teminsten twa jildige wearden yn teminsten ien genotypegroep op elk tiidpunt, en wurdt ekstrapoleare fan in normale ferdieling mei in breedte fan 0,0,3 en nei ûnderen gean 1,8. Brûk Perseus computing platfoarm (https://maxquant.net/perseus/) en R (https://r-project.org/) om de LFQ-resultaten te analysearjen. In twa-wei matige t-test fan it limma-softwarepakket waard brûkt foar differinsjele ekspresje-analyze (61). Ferkennende gegevensanalyze wurdt útfierd mei ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally en pheatmap. De TMT-basearre proteomics-gegevens waarden analysearre mei MaxQuant ferzje 1.6.10.43. Sykje nei rûge proteomika-gegevens út 'e minsklike proteomika-database fan UniProt, dy't yn septimber 2018 ynladen is. De analyze omfettet de korreksjefaktor foar isotoopsuverens levere troch de fabrikant. Brûk limma yn R foar differinsjele ekspresje-analyze. De orizjinele gegevens, databasesykresultaten en workflow en resultaten fan gegevensanalyze wurde allegear opslein yn 'e ProteomeXchange-alliânsje fia de PRIDE-partnerrepository mei de dataset-identifikator PXD019690.
Funksjonele annotaasjes ferrike de analyze. De Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ark waard brûkt om de rykdom fan 'e funksjonele annotaasjetermen fan' e dataset nei 8 wiken te bepalen (Ofbylding 1). Koartsein, de kwantitative proteïnelist dy't krigen is fan LC-MS/MS (tandem massaspektrometry) gegevensanalyze wurdt brûkt mei de folgjende filterkritearia: Mus musculus wurdt selektearre as de soarte en eftergrûn, en de kategory lit sjen dat de P-wearde oanpast troch Benjamini foar ferriking 0.05 of leger wurdt beskôge as signifikant. Foar dizze grafyk wurde de top fiif oerskotkategoryen yn elke kluster werjûn op basis fan 'e oanpaste P-wearde. Mei help fan meardere t-tests, mei it twa-faze lineêre boostprogramma fan Benjamini, Krieger, en Yekutieli (Q = 5%), wurdt tiidsferrin proteïne-ekspresje-analyze útfierd op 'e wichtige kandidaten dy't yn elke kategory identifisearre binne, en elke rige wurdt apart analysearre. It is net nedich om in konsekwinte SD oan te nimmen.
Om de resultaten fan dizze stúdzje te fergelykjen mei publisearre databases en in Venn-diagram te generearjen yn figuer 1, hawwe wy de kwantitative proteïnelist kombineare mei MitoCarta 2.0-annotaasjes (24). Brûk de online ark Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) om it diagram te generearjen.
Foar detaillearre ynformaasje oer de statistyske prosedueres dy't brûkt wurde foar proteomika-analyze, ferwize wy nei de oerienkommende seksje fan Materialen en Metoaden. Foar alle oare eksperiminten kin detaillearre ynformaasje fûn wurde yn 'e oerienkommende leginde. Behalven as oars oanjûn, wurde alle gegevens útdrukt as gemiddelde ± SEM, en alle statistyske analyses waarden útfierd mei de GraphPad Prism 8.1.2-software.
Foar oanfoljende materialen foar dit artikel, sjoch http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dit is in iepen tagongsartikel ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, dy't it gebrûk, de distribúsje en de reproduksje yn elk medium tastiet, salang't it definitive gebrûk net foar kommersjeel gewin is en it útgongspunt is dat it orizjinele wurk korrekt is. Referinsje.
Opmerking: Wy freegje jo allinich om jo e-mailadres op te jaan, sadat de persoan dy't jo oanbefelje oan 'e pagina wit dat jo wolle dat se de e-mail sjogge en dat it gjin spam is. Wy sille gjin e-mailadressen fêstlizze.
Dizze fraach wurdt brûkt om te testen oft jo in besiker binne en automatyske spamferstjoering te foarkommen.
By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika-analyze fan dysfunksjonele neuronen liet sjen dat metabolike programma's aktivearre wurde om neurodegeneraasje tsjin te gean.
By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomika-analyze fan dysfunksjonele neuronen liet sjen dat metabolike programma's aktivearre wurde om neurodegeneraasje tsjin te gean.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rjochten foarbehâlden. AAAS is in partner fan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.