Hjoeddeistich†Aktueel adres: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
It reaksjesintrum ljocht-rispingekompleks 1 (RC-LH1) is de kearn fotosyntetyske komponint fan pearse fototrofyske baktearjes. Wy yntrodusearren twa kryo-elektronenmikroskopiestrukturen fan it RC-LH1-kompleks fan Rhodopseudomonas palustris. De 2.65-Å resolúsjestruktuer fan it RC-LH114-W-kompleks bestiet út 14 subienheid LH1-lussen om RC hinne, dy't ûnderbrutsen wurdt troch proteïne W, wylst it kompleks sûnder proteïne-W folslein RC-komposysje hat omjûn troch RC. Sletten 16 subienheid LH1-lus. De fergeliking fan dizze struktueren jout ynsjoch yn 'e dynamyk fan kinon yn it RC-LH1-kompleks, ynklusyf earder net bepaalde konformaasjeferoarings by it binen fan kinon oan 'e RC QB-plak, lykas de lokaasje fan helpkinon-bindingsplakken, dy't helpe om se troch te jaan oan RC. De unike struktuer fan it W-proteïne foarkomt de sluting fan 'e LH1-lus, wêrtroch in kanaal ûntstiet foar it fersnellen fan 'e kinon/kinolon-útwikseling.
De enerzjy dy't troch fotosynteze levere wurdt, kin hast al it libben op ierde ûnderhâlde, en it hat in grut potinsjeel foar sinnebiotechnology. Wylst se wrâldwide fotosynteze befoarderje, litte pearse fototrofyske baktearjes ek ferskate enerzjymodi en metabolike mooglikheden sjen. Se kinne fotosynteze foarkomme en groeie as heterotrofyske baktearjes yn it tsjuster, kinne stikstof en koalstofdiokside fixearje, wetterstof produsearje en aromatyske ferbiningen ôfbrekke (1-3). Om enerzjy foar dizze prosessen te leverjen, moat ljocht fluch en effisjint omset wurde yn gemyske enerzjy. Dit proses begjint as it ljochtfangende antennekompleks ljocht absorbearret en de fongen enerzjy oerdraacht nei it reaksjesintrum (RC), wêrtroch ladingskieding begjint (4-7). De basisienheid fan fotosynteze yn pearse fototrofyske baktearjes bestiet út type 2 RC, omjûn troch ljochtrispingskompleks 1 (LH1), dat it RC-LH1-kearnkompleks foarmet. LH1 wurdt foarme troch in array fan bûgde αβ-heterodimeren, dy't elk twa baktearjele chlorofyl (BChl) a-molekulen en ien of twa karotenoïden (8-12) binde. De ienfâldichste LH1-antenne bestiet út 16 of 17 αβ heterodimeren dy't RC (9-13) yn in sletten lus omsirkelje, mar yn oare kearnkompleksen ûnderbrekke transmembraanpeptiden de kontinuïteit fan 'e omlizzende LH1, wêrtroch't de kinol/kinon-diffúzje tusken RC en cytochroom bc1-kompleks befoardere wurdt (11, 13-15). De pearse fototrofyske plant Rhodopseudomonas (Rps.) is in modelorganisme dat de enerzjy- en elektronoerdracht kin begripe dy't fotosynteze stipet. De earste kristalstruktuer fan Rps. It model fan it palustris RC-LH1-kompleks is RC, omjûn troch 15 heterodimere LH1-lussen, dy't ûnderbrutsen wurde troch in ûnbekend proteïne mei de namme "Protein W" (14). Proteïne-W waard letter identifisearre as RPA4402, dat in net-karakterisearre 10.5kDa-proteïne is mei trije foarseine transmembraanheliksen (TMH) (16). Wy stelle foar om it rpa4402-gen dat kodeart foar proteïne W te hernoemen nei pufW om konsekwint te wêzen mei de nomenklatuer dy't brûkt wurdt foar genen dy't kodearje foar RC-L, M (pufL, pufM) en LH1α, β (pufA, pufB) subeenheden. Nijsgjirrich is dat proteïne-W mar oanwêzich is yn sawat 10% fan RC-LH1, wat oantoant dat Rps. palustris twa ferskillende RC-LH1-kompleksen produseart. Hjir rapportearje wy de hege-resolúsje cryo-EM (kryo-EM) struktueren fan twa kearnkompleksen, ien mei proteïne W en 14 αβ heterodimeren, de oare sûnder proteïne W en in sletten 16 Heterodimer LH1-lus. Us struktuer fertsjintwurdiget in stapferoaring yn it begryp fan it RC-LH1-kompleks fan Rps. palustris, om't wy de homogene populaasje fan elke fariant analysearre hawwe en genôch resolúsje hawwe om elk peptide en bûne pigmenten en relatearre lipiden en kinonen dúdlik ta te wizen. De ferliking fan dizze struktueren lit sjen dat de trije TMH-proteinen-W dy't oant no ta net fûn binne yn in oar RC-LH1-kompleks in kinonkanaal generearje om de kinon/kinolon-útwikseling te fersnellen. In oantal konservearre lipide- en kinonbindingsplakken binne identifisearre, en wy hawwe in nije konformaasjeferoaring ûntdutsen nei de kombinaasje fan kinon en RC, dy't geskikt kin wêze foar fotosysteem II (PSII) RC fan soerstofrike fototrofyske organismen. Us befiningen jouwe nij ynsjoch yn 'e kinetika fan kinon/kinolonbinding en útwikseling yn it RC-LH1-kearnkompleks fan pearse fototrofyske baktearjes.
Om in detaillearre stúdzje fan 'e twa kompleksen fûn yn Rps. palustris te fasilitearjen, isolearje wy elke RC-LH1 troch biogemyske metoaden. It proteïne W-tekoart kompleks (hjirnei oantsjutten as ΔpufW) waard suvere fan 'e stam dy't it pufW-gen mist (16), en mar ien RC-LH1-kompleks kin produsearre wurde. It proteïne W-befetsjende kompleks wurdt produsearre troch in stam. It proteïne W fan dizze stam wurdt modifisearre mei in 10x His-tag oan syn C-terminus, sadat it proteïne W-befetsjende kompleks effektyf kombineare wurde kin mei it measte ûntbrekkende proteïne W troch metaal te immobilisearjen. It kompleks wurdt effektyf skieden (16) Affiniteitschromatografy (IMAC).
Lykas te sjen is yn figuer 1, befetsje beide kompleksen in RC mei trije sub-ienheden (RC-L, RC-M en RC-H) omjûn troch in LH1-antenne. De 2.80-A-struktuer fan it kompleks sûnder proteïne-W lit 16 αβ-heterodimeren sjen, dy't in sletten LH1-lus foarmje dy't RC folslein omfiemet, hjirnei oantsjutten as it RC-LH116-kompleks. De 2.65Å-struktuer fan it proteïne-W-befetsjende kompleks hat in 14-heterodimeer LH1 ûnderbrutsen troch proteïne-W, hjirnei oantsjutten as RC-LH114-W.
(A en B) Oerflakfoarstelling fan 'e ferbining. (C en D) Bûne pigmenten útdrukt yn stangen. (E en F) De kompleksen dy't waarnommen binne fan it cytoplasmatyske oerflak hawwe de peptiden en LH1-subienheden dy't fertsjintwurdige binne yn tekenfilms, en binne nûmere mei de klok mei fan 'e proteïne-W-gap [yn oerienstimming mei Rba-nûmering. sphaeroides-kompleks (13)]. Foar LH1-α is de kleur fan 'e proteïne-subeenheid giel; foar LH1-β is de kleur fan 'e proteïne-subeenheid blau; foar proteïne-W is it proteïne read; foar RC-H is it syaan; foar RC-L is it oranje; foar RC-M, magenta. Kofaktoaren wurde fertsjintwurdige troch stangen, grien fertsjintwurdiget BChl- en BPha-molekulen, pears fertsjintwurdiget karotenoïden, en giel fertsjintwurdiget UQ10-molekulen. (G en H) Fergrutte werjefte fan 'e proteïne-W-gap yn 'e lykweardige regio fan RC-LH114-W-kompleks (G) en RC-LH116-kompleks (H). Kofaktoaren wurde werjûn yn 'e foarm fan romtefolling, chelearre kinon wurdt werjûn yn blau. De proteïne-W gat wurdt markearre troch in blauwe stippele line yn (G), en de lytse gatten dêr't kinon/kinolol diffundearret op 'e LH116-ring binne markearre troch in swarte stippele line yn (H).
Figuer 1 (A en B) lit de RC sjen omjûn troch iepen of sletten rigen fan LH1αβ heterodimeren, dy't elk twa BChl en ien karotenoïde binde (Figuer 1, C en D). Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat Rps it LH1-kompleks is. Yn it biosyntetyske paad fan spirulina xanthin befetsje dizze soarten mingde populaasjes fan karotenoïden (17). Spiropyrroxanthin is lykwols de dominante karotenoïde en de tichtheid dêrfan is befredigjend. Dêrom hawwe wy keazen om spiroxanthin te modellearjen op alle LH1-bindingsplakken. De alfa- en beta-polypeptiden binne ienkele TMH's mei koarte membraan-bûtenste regio's (Figuer 1, A, B, E, en F). Hoewol de tichtheid fan 17 residuen oan 'e C-terminus net waarnommen waard, waard it alfa-polypeptid yn beide kompleksen fan Met1 nei Ala46 spjalte. β-polypeptid waard fermindere fan Gly4 nei Tyr52 yn RC-LH116, en fan Ser5 nei Tyr52 yn RC-LH114-W. Der waard gjin tichtens fan 3 of 4 N-terminale of 13 C-terminale residuen waarnommen (figuer S1). Massespektrometry-analyze fan it mingde RC-LH1-kompleks taret út 'e wylde-type-stam liet sjen dat de ûntbrekkende regio it resultaat wie fan heterologe splitsing fan dizze peptiden (figuer S1 en S2). De N-terminale formylaasje fan α-Met1 waard ek waarnommen (f). De analyze liet sjen dat it α-peptide bestiet út residuen fMet1 oant Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, en it β-peptide bestiet út residuen Ser2 oant Ala53, wat yn goede oerienkomst is mei de EM-tichtenskaart by lege temperatuer.
Koördinaasje fan α-His29 en β-His36 makket BChls face-to-face; elke αβ heterodimeer gearstallet mei syn buorlju om in iepen lus (RC-LH114-W) of in sletten lus (RC-LH116) om 'e RC te foarmjen. De exciton-keppele pigmentmatrix (Ofbylding 1, C en D). Yn ferliking mei de 877 nm-band fan RC-LH114-W is de 880 nm-absorpsjereadferskowing fan RC-LH116 3 nm (Ofbylding 2A). It sirkelfoarmige dichroïsmespektrum is lykwols hast itselde (Ofbylding 2B), wat oanjout dat hoewol d'r in dúdlik ferskil is tusken iepen en sletten lussen, de lokale omjouwing fan BChls tige ferlykber is. De absorpsjereadferskowing kin it resultaat wêze fan fermindere termyske beweging en ferhege stabiliteit op 'e sletten lus (18, 19), de feroaring yn pigmentkoppeling feroarsake troch de sletten lus (20, 21), of in kombinaasje fan dizze twa effekten (11).
(A) Ultrafiolet/sichtber/nei-ynfraread absorpsjespektrum, wêrfan de toppen markearre binne mei harren oerienkommende pigmenten en normalisearre nei de BPh-piek by 775 nm. (B) Sirkulêr dichroïsmespektrum normalisearre nei BChl-absorpsje by 805 nm. (C en D) Selektearre ΔA-spektra út 'e tiid-oploste absorpsjespektra fan RC-LH114-W-kompleks (C) en RC-LH116-kompleks (D). Foar bettere fergelykberens binne alle spektra normalisearre nei ∆A fan −A by 0.2 ps. (E) De snelheid fan cytochroom c2-oksidaasje nei bestraling yn 'e oanwêzigens fan ferskate konsintraasjes fan UQ2 (sjoch figuer S8 foar rûge gegevens). (F) Yn sellen groeid ûnder ljocht mei lege, middelgrutte of hege yntensiteit (respektyflik 10, 30 of 300 μMm-2 s-1), de proteïne W- en RC-L-subeenheden yn it suvere kompleks en de skieden membraanferhâlding. Bepale it proteïnenivo troch SDS-polyacrylamidegelelektroforese en immunoassay (sjoch figuer S9 foar rûge gegevens). Bepale de ferhâlding relatyf oan it suvere RC-LH114-W-kompleks. De stoichiometryske ferhâlding fan RC-L ta proteïne-W fan it kompleks is 1:1.
De BChl's op posysje 1 yn 'e misfoarme αβ14-lus fan RC-LH114-W (figuer 1, A, C, en E) binne 6,8 Å tichter by de primêre donor (P) fan RC as de lykweardige BChl's yn RC-LH116 (figuer 1, B, D, en F, en figuer S3); de tydlike absorpsjekinetyk fan 'e twa kompleksen lit lykwols sjen dat foar RC-LH114-W en RC-LH116 de tiidkonstanten foar oerdracht fan eksitaasje-enerzjy fan LH1 nei RC 40 ± 4 en 44 ± 3 ps binne (figuer 2, C en D, figuer S4 en tabel S2). Der is ek gjin signifikant ferskil yn elektroanyske oerdracht binnen RC (figuer S5 en relatearre oanfoljende tekst). Wy fermoedzje dat de nauwe oerienkomst fan 'e enerzjy-oerdrachttiid tusken LH1 en RC-P te tankjen is oan 'e ferlykbere ôfstân, hoeke en potinsjele enerzjy fan 'e measte BChl yn 'e twa LH1-lussen. It liket derop dat it ferkennen fan it LH1-enerzjypatroan om de minimale ôfstân te berikken net rapper is as direkte enerzjyoerdracht fan suboptimale plakken nei RC. De iepen-loop LH1-loop yn RC-LH114-W kin ek ûnbelangryke termyske beweging ûndergean ûnder lege temperatueromstannichheden foar strukturele analyze, en d'r is in langere αβ14-ringkonformaasje by keamertemperatuer fan 'e pigmentaasjeôfstân fan βBChls op 'e posysje fan RC 1.
It RC-LH116-kompleks befettet 32 ​​BChl's en 16 karotenoïden, en de algemiene opset is itselde as dy krigen fan Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stam (PDB ID 7C9R) (12) en griene algen (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Nei ôfstimming waarden allinich lytse ôfwikingen yn 'e posysjes fan αβ-heterodimeren waarnommen, benammen 1-5, 15 en 16 (figuer S6). De oanwêzigens fan proteïne-W hat in wichtige ynfloed op 'e struktuer fan LH1. De trije TMH's binne ferbûn troch koarte lussen, mei de N-terminal oan 'e lumenkant fan it kompleks en de C-terminal oan 'e cytoplasmatyske kant (figueren 1A en 3, A oant en mei D). Proteïne-W is foar in grut part hydrofoob (figuer 3B), en TMH2 en TMH3 ynteraksje mei LH1αβ-14 om in transmembraanoerflak te foarmjen (figuer 3, B en E oant G). De ynterface bestiet benammen út Phe-, Leu- en Val-residuen yn 'e transmembraanregio. Dizze residuen binne steapele mei hydrofobe aminosoeren en αβ-14-pigmenten. Guon poalresiduen drage ek by oan 'e ynteraksje, ynklusyf de wetterstofbining tusken W-Thr68 en β-Trp42 op it oerflak fan 'e komplekse holte (figuer 3, F en G). Op it oerflak fan it cytoplasma leit Gln34 neist de ketogroep fan αβ-14-karotenoïden. Derneist waard it n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM)-molekule oplost, en syn hydrofobe sturt útwreide nei de ynterface tusken proteïne-W en αβ-14, en de lipidesturt kin yn it lichem lizze. Wy hawwe ek opmurken dat de C-terminale resolúsjeregio's fan proteïne W en RCH tige tichtby inoar lizze, mar net binnen it berik fan it foarmjen fan spesifike ynteraksjes (Ofbylding 1, A en E). D'r kinne lykwols ynteraksjes wêze yn 'e net-oploste C-terminale aminosoeren fan dizze twa proteïnen, wat in meganisme kin leverje foar de rekrutearring fan proteïne-W tidens de gearstalling fan it RC-LH114-W-kompleks.
(A) Proteïne-W, dat yn tekenfilmfoarm nei de ynterface mei LH1αβ14 rjochte is, hat in stêffoarmige sydketen (read), werjûn yn in diel fan it elektrostatysk potinsjeeldiagram (transparant griis oerflak mei in kontoernivo fan 0.13). (B) Proteïne-W fertsjintwurdige troch in hydrofoob kleurd oerflak. Poal- en laden gebieten wurde werjûn yn syaan, hydrofobe gebieten wurde werjûn yn wyt, en sterk hydrofobe gebieten wurde werjûn yn oranje. (C en D) Proteïne-W fertsjintwurdige yn tekenfilm, syn oriïntaasje is itselde as yn (A) (C), en rotearre mei 180° (D). Neffens de posysje yn 'e sekwinsje nimme de ûnderskiedbere residuen in reinbôgekleurskema oan, wêrby't de N-terminal blau is en de C-terminal read. (E) Proteïne-W yn deselde werjefte as yn (A), en de residuen op 'e ynterface fan proteïne-W:LH1 wurde fertsjintwurdige troch stêven mei oanhingjende markearrings. (F) Proteïne-W is 90° draaid relatyf oan (E) en LH1αβ14 yn 'e tekenfilmfoarstelling, en relatyf oan 'e ynterface-residuen yn 'e balkefoarstelling. De oerhingjende residuen fan it beta-polypeptide binne markearre. De kofaktor wurdt werjûn as in balke dy't oerienkomt mei de kleur fan figuer 1, de ûntbûne β-DDM wurdt werjûn yn griis, en de soerstof wurdt werjûn yn read. (G) De werjefte yn (F) is 180° draaid, mei de promininte residuen fan it markearre alfa-polypeptide.
Proteïne-W ferfangt in αβ heterodimeer (de 15e yn Figuer 1F), wêrtroch't lussluting foarkommen wurdt en de earste trije αβ heterodimeren kantele wurde. Der waard waarnommen dat de maksimale hellingshoeke fan 'e earste αβ-1 heterodimeer relatyf oan 'e filmnormaal 25° oant 29° wie (Figuer 1, A en E), dy't foarme waard troch de 2° oant 8° helling fan αβ-1 yn RC A sharp contrast-LH116 (Figuer 1, B en F). De twadde en tredde heterodimeren binne helle ûnder respektivelik 12° oant 22° en 5° oant 10°. Fanwegen de steryske hinder fan RC omfettet de kanteling fan αβ-1 it twadde pear fan αβ net (dat oerienkomt mei de 16e αβ yn Figuer 1F), wêrtroch't in dúdlike gat yn 'e LH1-ring ûntstiet (Figuer 1, A en E). Troch it ûntbrekken fan twa αβ-heterodimeren, begelaat troch it ferlies fan fjouwer BChl en twa karotenoïden, bine gjin fan 'e karotenoïden oan 'e ferdraaide αβ-1-subeenheid, wat resulteart yn in LH114-W-ring mei 13 karotenoïden Vegetarian en 28 BChl's. De lokale resolúsjeskattings fan 'e twa kompleksen yn 'e αβ1 oant 7 regio's binne leger as dy fan 'e rest fan 'e LH1-lus, wat de ynherinte plastisiteit fan 'e LH1-subeenheid neist de RC QB-side kin reflektearje (Ofbylding 4).
De ôfbyldings fan RC-LH114-W (A en B) en RC-LH116 (C en D) wurde werjûn fanút itselde boppe-oansicht/sydoansicht (A en B) (A en C) en holte-oerflak fan Fig. 1. (B en D). De kleurde toetsen wurde oan 'e rjochterkant werjûn.
It ienige oare karakteristike kearnkompleks mei in stoichiometryske ferhâlding fan 1:14 is de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeer (13). Proteïne W en PufX hawwe lykwols gjin dúdlike homology, en hawwe in wichtige ynfloed op har respektive LH1-strukturen. PufX is in inkele TMH mei in N-terminaal cytoplasmatysk domein dat ynteraksje hat mei de cytoplasmatyske kant fan 'e RC-H-subeenheid (13) op in posysje dy't oerienkomt mei Rps. palustris LH116αβ-16. PufX makket in kanaal foar de kinon/kinolon-útwikseling tusken RC-LH1 en it cytochroom bcl-kompleks en is oanwêzich yn alle Rba. sphaeroides kearnkompleks (13). Hoewol de monomeer-monomeer-ynterface yn Rba is. De sphaeroides RC-LH1-PufX dimeer leit op 'e bindingsposysje fan proteïne W yn RC-LH114-W, en de gat feroarsake troch PufX en proteïne-W is op in lykweardige posysje (Ofbylding S7A). De gat yn RC-LH114-W is ek ôfstimd mei it hypotetyske kinonkanaal (8) fan Pseudomonas rosea LH1, dat foarme wurdt troch peptiden dy't net besibbe binne oan proteïne W of PufX (Ofbylding S7B). Derneist leit it kinonkanaal yn Blc. De smaragdgriene LH1 foarme troch it útsluten fan ien γ-subeenheid (7) leit op in ferlykbere posysje (Ofbylding S7C). Hoewol bemiddele troch ferskate proteïnen, liket it ferskinen fan dizze kinon/kinololkanalen op in mienskiplike posysje yn it RC-LH1-kompleks in foarbyld te wêzen fan konvergente evolúsje, wat oanjout dat de gat makke troch proteïne W kin fungearje as in kinonkanaal.
De gat yn 'e LH114-W-lus makket de foarming mooglik fan in trochgeande membraanregio tusken de ynterne romte fan it RC-LH114-W-kompleks en it bulkmembraan (figuer 1G), ynstee fan de twa domeinen te ferbinen fia in proteïnepoar lykas yn proteïnen. It RC-LH116-kompleks is fergelykber mei in sletten Tch. Needle-like kompleks (22) (figuer 1H). Om't de diffúzje fan kinon troch it membraan rapper is as de diffúzje troch it smelle proteïnekanaal, kin de iepen LH114-W-lus in rapper RC-omset tastean as de sletten LH116-lus, en de diffúzje fan kinon yn 'e RC kin beheinder wêze. Om te testen oft proteïne W ynfloed hat op 'e konverzje fan kinonen fia RC, hawwe wy in cytochroom-oksidaasjetest útfierd op in bepaalde konsintraasje fan ubiquinon 2 (UQ2) (in analoog fan natuerlik UQ10 mei in koartere isopreensturt) (figuer 2E). Hoewol't de oanwêzigens fan chelearre kinon de krekte bepaling fan 'e skynbere Michaelis-konstante hinderet (RC-LH114-W en RC-LH116 binne geskikt foar respektivelik 0,2 ± 0,1 μM en 0,5 ± 0,2 μM), is de maksimale snelheid fan RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5% grutter as RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Wy skatten yn earste ynstânsje dat proteïne-W oanwêzich is yn sawat 10% fan it kearnkompleks (16); hjir binne de besettingsraten fan groeisellen mei leech ljocht, middelljocht en heech ljocht respektivelik 15 ± 0,6%, 11 ± 1% en 0,9 ± 0,5% (figuer 2F). Kwantitative ferliking fan massaspektrometry liet sjen dat de tafoeging fan histidine-tag de relative oerfloed fan proteïne-W net fermindere yn ferliking mei wyldtypestammen (P = 0,59), dus dizze nivo's binne gjin artefakt fan modifisearre proteïne-W (figuer S10). Dizze lege besettingsgraad fan proteïne-W yn it RC-LH1-kompleks kin lykwols tastean dat guon RC's mei in fersnelde snelheid omskeakelje, wêrtroch't de stadiger kinon/kinolon-útwikseling yn it RC-LH116-kompleks wurdt fermindere. Wy hawwe opmurken dat de hege besettingsgraad fan ljocht net oerienkomt mei de resinte transkriptomika-gegevens, dy't oanjaan dat pufW-genekspresje tanimt ûnder sterk ljocht (figuer S11) (23). It ferskil tusken pufW-transkripsje en proteïne-W-ynkorporaasje yn it RC-LH1-kompleks is betiizjend en kin de komplekse regeling fan it proteïne reflektearje.
Yn RC-LH114-W binne 6 kardiolipine (CDL), 7 fosfatidylcholine (POPC), 1 fosfatidylglycerol (POPG) en 29 β-DDM-molekulen tawiisd en modellearre dêryn 6 CDL's, 24 POPC's, 2 POPG's en 12 βDDM's. RC-LH116 (Ofbylding 5, A en B). Yn dizze twa struktueren leit CDL hast oan 'e cytoplasmatyske kant fan it kompleks, wylst POPC, POPG en β-DDM meast oan 'e luminale kant lizze. Twa lipide- en detergentmolekulen waarden isolearre yn 'e αβ-1 oant αβ-6-regio fan it RC-LH114-W-kompleks (Ofbylding 5A), en fiif waarden isolearre yn 'e lykweardige regio fan RC-LH116 (Ofbylding 5B). Oan 'e oare kant fan it kompleks waarden mear lipiden fûn, benammen CDL, dy't opboud wiene tusken RC en αβ-7 oant αβ-13 (figuer 5, A en B). Oare struktureel oploste lipiden en detergenten lizze bûten de LH1-ring, en goed oploste acylketens strekke har út tusken LH1-subienheden, tydlik oantsjutten as β-DDM yn RC-LH114-W, en definiearre as β-DDM yn RC In mingsel fan β-DDM en POPC-LH116. De ferlykbere posysjes fan chelearjende lipiden en detergenten yn ús struktuer jouwe oan dat se fysiologysk relevante bindingsplakken binne (figuer S12A). De posysjes fan lykweardige molekulen yn Tch hawwe ek in goede konsistinsje. Gentle en Trv. Stam 970 RC-LH1s (figuer S12, B oant E) (9, 12) en de wetterstofbiningsresiduen fan 'e lipidekopgroep lieten frij goede behâld sjen yn 'e sekwinsje-ôfstimming (figuer S13), wat oanjout dat konservearre CDL dy't bindt oan RC (24), dizze plakken mooglik konservearre binne yn it RC-LH1-kompleks.
(A en B) RC-LH114-W (A) en RC-LH116 (B) peptiden wurde fertsjintwurdige troch tekenfilms, en de pigmenten wurde fertsjintwurdige troch stêven, mei it kleurskema yn figuer 1. Lipiden wurde werjûn yn read, en detergenten wurde werjûn yn griis. UQ bûn oan RC QA- en QB-plakken is giel, wylst isolearre UQ blau is. (C en D) Deselde werjeften as (A) en (B), mei lipiden weilitten. (E oant G) Fergrutte werjefte fan Q1(E), Q2(F) en Q3(G) fan RC-LH116, mei sydketens dy't elkoar beynfloedzje. De wetterstofbiningen wurde werjûn as swarte stippele linen.
Yn RC-LH116 wurde sawol RC QA as QB UQ, dy't meidogge oan elektronoerdracht yn it ladingsskiedingsproses, ôfbrutsen yn har bindingsplakken. Yn RC-LH114-W is QB-kinon lykwols net oplost en sil hjirûnder yn detail besprutsen wurde. Neist QA- en QB-kinonen binne twa chelearre UQ-molekulen (lizze tusken de RC- en LH1-ringen) tawiisd yn 'e RC-LH114-W-struktuer neffens har goed oploste kopgroepen (lizze yn Q1 en Q2, respektivelik). romte). Figuer 5C). Twa isopreen-ienheden binne tawiisd oan Q1, en de tichtheidskaart lost de folsleine 10 isopreensturten fan Q2 op. Yn 'e struktuer fan RC-LH116 waarden trije chelearre UQ10-molekulen (Q1 oant Q3, Figuer 5D) oplost, en alle molekulen hawwe in dúdlike tichtheid yn 'e heule sturt (Figuer 5, D oant G). Yn 'e twa struktueren hawwe de posysjes fan 'e kinonkopgroepen fan Q1 en Q2 in poerbêste konsistinsje (figuer S12F), en se ynteraksje allinich mei RC. Q1 leit by de yngong fan 'e W-gap fan RC-LH114-W (figuer 1G en 5, C, D en E), en Q2 leit tichtby de QB-bindingsplak (figuer 5, C, D) en F). De konservearre L-Trp143- en L-Trp269-residuen binne tige ticht by Q1 en Q2 en leverje potinsjele π-stacking-ynteraksjes (figuer 5, E en F, en figuer S12). L-Gln88, 3.0 Å fan 'e distale soerstof fan Q1, leveret in sterke wetterstofbining (figuer 5E); dit residu is konservearre yn alle RC's útsein de fierste relaasje (figuer S13). L-Ser91 wurdt konservatyf ferfongen troch Thr yn de measte oare RC's (figuer S13), is 3.8 Ångström fan 'e metylsoerstof fan Q1, en kin swakke wetterstofbiningen leverje (figuer 5E). Q3 liket gjin spesifike ynteraksje te hawwen, mar leit yn 'e hydrofobe regio tusken de RC-M-subeenheid en de LH1-α-subeenheid 5 oant 6 (figuer 5, D en G). Q1, Q2 en Q3 of tichtby lizzende chelearre kinonen binne ek oplost yn Tch. Gentle, Trv. Strain 970 en Blc. De irisstruktuer (9, 10, 12) wiist nei in konservearre helpkinonbindingsplak yn it RC-LH1-kompleks (figuer S12G). De fiif ûntbûne UQ's yn RC-LH116 binne yn goede oerienkomst mei de 5.8 ± 0.7 fan elk kompleks bepaald troch hege prestaasjes floeistofchromatografy (HPLC), wylst de trije ûntbûne UQ's yn RC-LH114-W leger binne as De mjitten wearde fan 6.2 ± 0.3 (Fig. S14) jout oan dat der ûnoploste UQ-molekulen yn 'e struktuer binne.
De pseudo-symmetryske L- en M-polypeptiden befetsje elk fiif TMH's en foarmje in heterodimeer dy't ien BChl-dimeer, twa BChl-monomeren, twa bakteriofaag (BPh)-monomeren, en ien net-heemizer en ien of twa UQ10-molekulen kombinearret. Troch de oanwêzigens fan wetterstofbiningen op 'e terminale ketongroep en de bekende opgarjen yn Rps, wurde karotenoïden opnommen yn 'e M-subeenheid, dy't cis-3,4-dehydroorhodopin neamd wurdt. Soarten (25). It bûtenste membraandomein fan RC-H is ferankere oan it membraan troch ien TMH. De algemiene RC-struktuer is fergelykber mei de trije subienheden RC fan besibbe soarten (lykas Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). De makrosyklusen fan BChl en BPh, de karotenoïde rêchbonke en net-heemizer oerlaapje binnen it resolúsjeberik fan dizze struktueren, lykas de UQ10-kopgroep op 'e QA-side en it QB-kinon op RC-LH116 (Ofbylding S15).
De beskikberens fan twa RC-strukturen mei ferskillende QB-plakbesettingsraten biedt in nije kâns om de konsekwinte konformaasjeferoarings te ûndersiikjen dy't gepaard geane mei QB-kinonbinding. Yn it RC-LH116-kompleks leit QB-kinon yn 'e folslein bûne "proksimale" posysje (26), mar de skieding fan RC-LH114-W hat gjin QB-kinon. Der is gjin QB-kinon yn RC-LH114-W, wat ferrassend is, om't it kompleks aktyf is, mear as it RC-LH116-kompleks mei struktureel oplost QB-kinon. Hoewol de twa LH1-ringen sawat seis kinonen chelearje, binne fiif struktureel oplost yn 'e sletten RC-LH116-ring, wylst mar trije struktureel beheind binne yn 'e iepen RC-LH114-W-ring. Dizze ferhege strukturele steurnis kin de rapper ferfanging fan RC-LH114-W QB-plakken, rapper kinonkinetyk yn it kompleks, en ferhege kâns op it oerstekken fan 'e LH1-lus reflektearje. Wy suggerearje dat it ûntbrekken fan UQ yn 'e RC QB-side fan RC-LH114-W it resultaat kin wêze fan in komplekser en aktiver kompleks, en de QB-side fan RC-LH114-W is fuortendaliks beferzen yn UQ-omset. It spesifike stadium (de yngong nei de QB-side is sluten) reflektearret de konformaasje fan dizze aktiviteit.
Sûnder QB, de begeliedende rotaasje fan L-Phe217 nei in posysje dy't net kompatibel is mei UQ10-binding, om't it in romtlike botsing mei de earste isopreen-ienheid fan 'e sturt sil feroarsaakje (Ofbylding 6A). Derneist binne de dúdlike wichtichste konformaasjeferoarings dúdlik, benammen de helix de (koarte helix yn 'e lus tusken TMH D en E) wêr't L-Phe217 nei de QB-bindingsbûse ferskowe wurdt en de rotaasje fan L-Tyr223 (Ofbylding 6A) om de wetterstofbining mei it M-Asp45-raamwurk te brekken en de yngong fan 'e QB-bindingsplak te sluten (Ofbylding 6B). Helix de draait oan syn basis, de Cα fan L-Ser209 wurdt mei 0,33 Å ferskowe, wylst de L-Val221Cα mei 3,52 Å ferskowe wurdt. Der binne gjin waarnimbere feroarings yn TMH D en E, dy't superimposearber binne yn beide struktueren (Ofbylding 6A). Foar safier't wy witte, is dit de earste struktuer yn 'e natuerlike RC dy't de QB-plak slút. In ferliking mei de folsleine (QB-bûne) struktuer lit sjen dat foardat it kinon redusearre wurdt, in konformaasjeferoaring nedich is om it yn it kinon te krijen. L-Phe217 rotearret om in π-stapelingynteraksje te foarmjen mei de kinonkopgroep, en de helix ferskowt nei bûten, wêrtroch't it skelet fan L-Gly222 en de sydketen fan L-Tyr223 in wetterstofbiningnetwurk foarmje kinne mei in stabile wetterstofbiningstruktuer (Ofbylding 6, A en C).
(A) Oerlappende tekenfilm fan hologram (L-keten, oranje/M-keten, magenta) en apo (grize) struktuer, wêryn't de wichtichste residuen werjûn wurde yn 'e foarm fan in stêffoarmige foarstelling. UQ10 wurdt foarsteld troch in giele balke. De stippele line jout de wetterstofbiningen oan dy't yn 'e heule struktuer foarme binne. (B en C) De oerflakfoarstelling fan it apolipoproteïne en de heule ringstruktuer, wêrby't de sydketensoerstof fan L-Phe217 yn blau en L-Tyr223 yn read markearre wurdt, respektivelik. De L-subeenheid is oranje; de ​​M- en H-subienheden binne net kleurd. (D en E) Apolipoproteïne (D) en hiele (E) RC QB-plakken [kleurje neffens (A) respektivelik] en Thermophilus thermophilus PSII (grien, blau mei plestik kinon; PDB ID: 3WU2) Útlijnje (58).
Unferwachts, hoewol ferskate struktueren fan QB-tekoart RC's sûnder LH1 beskikber binne, binne de konformaasjeferoaringen dy't yn dizze stúdzje waarnommen binne, net earder rapportearre. Dizze omfetsje de QB-útputtingstruktuer fan Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) en Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), dy't allegear hast itselde binne as har algemiene QB-struktuer. Nauwkeurige ynspeksje fan 3PRC liet sjen dat LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) detergentmolekulen bine oan 'e yngong fan' e QB-posysje, wat opnij rangskikking yn in sletten konformaasje kin foarkomme. Hoewol LDAO net op deselde posysje yn 1EYS of 1OGV ûntlient, wurde dizze RC's taret mei itselde detergent en kinne dêrom itselde effekt produsearje. De kristalstruktuer fan Rba. Sphaeroides RC ko-kristallisearre mei cytochroom c2 (PDB ID: 1L9B) liket ek in sletten QB-plak te hawwen. Yn dit gefal nimt de N-terminale regio fan it RC-M-polypeptide (dy't ynteraksje hat mei de QB-bindingsplak fia de H-bining fan it Tyr-residu op 'e Q-helix) lykwols in ûnnatuerlike konformaasje oan, en de QB-konformaasjeferoaring wurdt net fierder ûndersocht (30). Wat gerêststellend is, is dat wy dit soarte deformaasje fan it M-polypeptide net sjoen hawwe yn 'e RC-LH114-W-struktuer, dy't hast itselde is as de N-terminale regio fan RC-LH116 RC. It moat ek opmurken wurde dat nei it útroegjen fan 'e op detergent basearre LH1-antenne, de apolipoproteïne RC's yn 'e PDB oplost waarden, wêrtroch't de ynterne kinonpools en lipiden yn 'e gat tusken de RC en it binnenste oerflak fan 'e omlizzende LH1-ring eliminearre waarden (31, 32). RC bliuwt funksjoneel om't it alle kofaktoren behâldt, útsein it ôfbrekbere QB-kinon, dat minder stabyl is en faak ferlern giet tidens it tariedingsproses (33). Derneist is it bekend dat it fuortheljen fan LH1 en natuerlike sykliske lipiden út RC ynfloed kin hawwe op funksjes, lykas de ferkoarte libbensdoer fan 'e ladingsskieden P+QB-steat (31, 34, 35). Dêrom spekulearje wy dat it bestean fan 'e lokale LH1-ring om 'e RC de "sletten" QB-side kin behâlde, wêrtroch't de lokale omjouwing tichtby de QB bewarre bliuwt.
Hoewol apolipoproteïne (sûnder QB-kinon) en de folsleine struktuer mar twa momintopnamen fertsjintwurdigje fan 'e omset fan' e QB-side, ynstee fan in searje barrens, binne d'r oanwizings dat de binding kin wurde kontrolearre om opnij binding troch hydrokinon te foarkommen om substraatynhibysje te remmen. De ynteraksje fan kinolol en kinon tichtby de QB-side fan apolipoproteïne kin oars wêze, wat liedt ta syn ôfwizing troch RC. It is lang foarsteld dat konformaasjeferoarings in rol spylje yn 'e binding en reduksje fan kinonen. It fermogen fan beferzen RC's om kinonen te ferminderjen nei tsjustere oanpassing is beheind (36); Röntgenkristallografy lit sjen dat dizze skea te tankjen is oan QB-kinonen dy't finzen sitte yn in "distale" konformaasje sawat 4,5 Å fan 'e aktive proksimale posysje (26, 37). Wy suggerearje dat dizze distale bindingskonformaasje in momintopname is fan 'e tuskensteat tusken apolipoproteïne en de folsleine ringstruktuer, dy't folget op 'e earste ynteraksje mei kinon en de iepening fan' e QB-side.
De type II RC dy't fûn wurdt yn it PSII-kompleks fan bepaalde fototrofyske baktearjes en cyanobaktearjes, algen en planten hat strukturele en funksjonele behâld (38). De strukturele ôfstimming werjûn yn figuer 6 (D en E) beklammet de oerienkomst tusken PSII RC's en de QB-side fan it baktearjele RC-kompleks. Dizze ferliking is lang in model west foar it bestudearjen fan 'e nau besibbe systemen fan kinonbinding en reduksje. Eardere publikaasjes suggerearren dat konformaasjeferoarings wurde begelaat troch PSII-reduksje fan kinonen (39, 40). Dêrom, sjoen de evolúsjonêre behâld fan RC, kin dit earder net waarnommen bindingsmeganisme ek fan tapassing wêze op 'e QB-side fan PSII RC yn soerstofrike fototrofyske planten.
Rps ΔpufW (ûnlabelde pufW-deleasje) en PufW-His (C-terminale 10x His-tagged proteïne-W útdrukt út 'e natuerlike pufW-lokus) stammen. palustris CGA009 waard beskreaun yn ús eardere wurk (16). Dizze stammen en de isogene wylde-type âlder waarden út 'e friezer helle troch in lyts oantal sellen te streaken op PYE (elk 5 g liter -1) (opslein yn LB by -80 °C, mei 50% (w/v) glycerol) proteïne, gistextract en succinaat) agar [1,5% (w/v)] plaat. De plaat waard oernachtich yn it tsjuster by keamertemperatuer ûnder anaerobe omstannichheden ynkubearre, en doe ferljochte mei wyt ljocht (~50 μmolm-2 s-1) levere troch OSRAM 116-W halogeenlampen (RS Components, UK) foar 3 oant 5 dagen oant in inkele koloanje ferskynde. In inkele koloanje waard brûkt om 10 ml M22+ medium (41) oanfolle mei 0,1% (w/v) casaminosoeren (hjirnei oantsjutten as M22) te ynokulearjen. De kultuer waard ûnder lege soerstofomstannichheden yn it tsjuster by 34 °C mei skodzjen by 180 rpm foar 48 oeren groeid, en doe waard 70 ml fan 'e kultuer ûnder deselde omstannichheden foar 24 oeren ynokulearre. In semi-aerobe kultuer mei in folume fan 1 ml wurdt brûkt om 30 ml M22-medium yn in universele skroefdop transparante glêzen flesse fan 30 ml te ynokulearjen en 48 oeren lang mei skodzjen (~50 μmolm-2 s-1) te bestralen mei in sterile magnetyske roerstaaf. Dêrnei waard 30 ml fan 'e kultuer ûnder deselde omstannichheden ynokulearre mei sawat 1 liter kultuer, dy't doe brûkt waard om sawat 9 liter kultuer te ynokulearjen dy't 72 oeren lang by ~200 μmolm-2 s-1 ferljochte wie. De sellen waarden rispe troch sintrifugaasje by 7132 RCF foar 30 minuten, opnij suspendearre yn ~10 ml fan 20 mM tris-HCl (pH 8.0), en opslein by -20 °C oant nedich.
Nei it ûntdooijen, foegje wat kristallen fan deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozym (Merck, UK) en twa Roche holoenzyme protease-ynhibitortabletten (Merck, UK) ta oan 'e opnij suspendearre sellen. Yn in Frânske druksel fan 20.000 psi (Aminco, FS) waarden de sellen 8 oant 12 kear ûnderbrutsen. Nei it fuortheljen fan net-brutsen sellen en ûnoplosbere resten troch sintrifugaasje by 18.500 RCF foar 15 minuten by 4 °C, waard it membraan út it pigmentearre lysaat precipitearre troch sintrifugaasje by 113.000 RCF foar 2 oeren by 43.000 °C. Smyt de oplosbere fraksje fuort en resuspendearje it kleurde membraan yn 100 oant 200 ml fan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) en homogenisearje oant der gjin sichtbere aggregaten mear binne. It suspendearre membraan waard ynkubearre yn 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Feriene Steaten) mei 2% (w/v) β-DDM foar 1 oere yn it tsjuster by 4°C mei sêft roeren. Dêrnei sintrifugearje by 70°C om 150.000 RCF op te lossen by 4°C foar 1 oere om oerbleaune ûnoplosbere stoffen te ferwiderjen.
It oplosbere membraan fan 'e ΔpufW-stam waard oanbrocht op in 50 ml DEAE Sepharose-ionenwikselkolom mei trije kolomvolumes (CV) fan bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) mei 0.03% (w/v) β-DDM]. Waskje de kolom mei twa CV-bindingsbuffers, en waskje dan de kolom mei twa bindingsbuffers mei 50 mM NaCl. It RC-LH116-kompleks waard eluearre mei in lineêre gradiënt fan 150 oant 300 mM NaCl (yn bindingsbuffer) op 1.75 CV, en it oerbleaune bindingskompleks waard eluearre mei in bindingsbuffer mei 300 mM NaCl op 0.5 CV. Sammelje it absorpsjespektrum tusken 250 en 1000 nm, hâld de fraksje mei in absorpsjeferhâlding (A880/A280) grutter as 1 by 880 oant 280 nm, ferdun it twa kear yn 'e bindingsbuffer, en brûk deselde proseduere opnij op 'e DEAE-kolom by suvering. Ferdun de fraksjes mei A880/A280-ferhâldingen heger as 1.7 en A880/A805-ferhâldingen heger as 3.0, fier de tredde ronde fan ionútwikseling út, en hâld fraksjes mei A880/A280-ferhâldingen heger as 2.2 en A880/A805-ferhâldingen heger as 5.0. It foar in part suvere kompleks waard konsintrearre ta ~2 ml yn in Amicon 100.000 molekulêre gewichtsgrinspunt (MWCO) sintrifugale filter (Merck, UK), en laden op in Superdex 200 16/600 grutte-útslutingskolom (GE Healthcare, FS) mei 200 mM NaCl-buffer, en doe eluearre yn deselde buffer by 1,5 CV. Sammelje de absorpsjespektra fan 'e grutte-útslutingsfraksje, en konsintrearje de absorpsjespektra mei A880/A280-ferhâldingen boppe 2,4 en A880/A805-ferhâldingen boppe 5,8 oant 100 A880, en brûk se fuortendaliks foar cryo-TEM-rastertarieding of opslach. Bewarje by -80 °C oant nedich.
It oplosbere membraan fan 'e PufW-His-stam waard tapast op in 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolom (20 mM tris-HCl (pH 8.0) mei 200 mM NaCl en 0.03% (w/w)) yn IMAC-buffer (GE Healthcare). (v) β-DDM]. De kolom waard wosken mei fiif CV's fan IMAC-buffer, en dêrnei mei fiif CV's fan IMAC-buffer mei 10 mM histidine. It kearnkompleks waard út 'e kolom eluearre mei fiif IMAC-buffers mei 100 mM histidine. De fraksje mei it RC-LH114-W-kompleks wurdt konsintrearre ta ~10 ml yn in roertank foarsjoen fan in Amicon 100.000 MWCO-filter (Merck, UK), 20 kear ferdund mei bindingsbuffer, en dêrnei tafoege oan 25 ml. Yn 'e DEAE Sepharose-kolom wurde fjouwer CV's dy't oan 'e buffer bûn binne foarôf brûkt. Waskje de kolom mei fjouwer CV-biningsbuffers, eluearje dan it kompleks op acht CV's op in lineêre gradiënt fan 0 oant 100 mM NaCl (yn biningsbuffer), en de oerbleaune fjouwer CV's mei 100 mM biningsbuffer. De oerbleaune kompleksen eluearre op it natriumchloride kombinearre mei de A880/A280-ferhâlding heger as 2,4 en de A880/A805-ferhâlding heger as 4,6 fraksjes waarden konsintrearre ta ~2 ml yn in Amicon 100.000 MWCO sintrifugaalfilter, en fol mei 1,5 CV IMAC fan tefoaren Buffer-lykwichtich makke Superdex 200 16/600 grutte-útslutingskolom, en dan eluearre yn deselde buffer oer 1,5 CV. Sammelje de absorpsjespektra fan 'e grutte-útslutingsfraksjes en konsintrearje de absorpsjespektra mei A880/A280-ferhâldingen boppe 2.1 en A880/A805-ferhâldingen boppe 4.6 oant 100 A880, dy't direkt brûkt wurde foar de tarieding fan beferzen TEM-raster of opslein wurde by -80°C oant nedich.
In Leica EM GP immersjefrizer waard brûkt om TEM-rasters by lege temperatuer ta te rieden. It kompleks waard ferdund yn IMAC-buffer ta A880 fan 50, en doe waard 5 μl laden op in nij gloei-ûntladen QUANTIFOIL 1.2/1.3 koalstof-coated koperen gaas (Agar Scientific, UK). Ynkubearje it raster by 20 °C en 60% relative fochtigens foar 30 sekonden, dep it dan 3 sekonden droech, en blust it dan yn floeibere etaan by -176 °C.
De gegevens fan it RC-LH114-W-kompleks waarden opnommen op 'e eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) mei in Titan Krios-mikroskoop, dy't wurket op in fersnellingsspanning fan 300 kV, mei in nominale fergrutting fan 130.000 × en in enerzjy fan - Kies in gat fan 20 eV. In Gatan 968 GIF Quantum mei K2-piekdetektor waard brûkt om ôfbyldings op te nimmen yn tellemodus om gegevens te sammeljen. De kalibrearre pikselgrutte is 1.048 Å, en de dosisrate is 3.83 e-Å-2s-1. De film waard yn 11 sekonden sammele en ferdield yn 40 dielen. Brûk it mei koalstof bedekte gebiet om de mikroskoop opnij te fokusjen, en sammelje dan trije films per gat. Yn totaal waarden 3130 films sammele, mei defokuswearden tusken -1 en -3 μm.
De gegevens foar it RC-LH116-kompleks waarden sammele mei deselde mikroskoop by it Asterbury Biostructure Laboratory (Universiteit fan Leeds, UK). De gegevens waarden sammele yn tellemodus mei in fergrutting fan 130 k, en de pikselgrutte waard kalibrearre nei 1.065 Å mei in doasis fan 4.6 e-Å-2s-1. De film waard opnommen yn 12 sekonden en ferdield yn 48 dielen. Yn totaal waarden 3359 films sammele, mei defokuswearden tusken -1 en -3μm.
Alle gegevensferwurking wurdt útfierd yn 'e Relion 3.0 pipeline (42). Brûk Motioncorr 2 (43) om de strielbeweging te korrigearjen troch dosisgewichting, en brûk dan CTFFIND 4.1 (44) om de CTF (kontrast oerdrachtfunksje) parameter te bepalen. Typyske fotomikrografyen nei dizze earste ferwurkingsstadia wurde werjûn yn figuer 2. S16. De automatyske seleksjesjabloan wurdt generearre troch sawat 250 piksels fan 1000 dieltsjes manuell te selektearjen yn in frame fan 250 piksels en gjin referinsje twadiminsjonale (2D) klassifikaasje, wêrtroch't dy klassifikaasjes dy't foldogge oan stekproefkontaminaasje of gjin ûnderskiedbere skaaimerken hawwe, ôfwiisd wurde. Dêrnei waard automatyske seleksje útfierd op alle mikrofoto's, en de RC-LH114-W wie 849.359 dieltsjes, en it RC-LH116-kompleks wie 476.547 dieltsjes. Alle selektearre dieltsjes hawwe twa rûndes fan net-referinsje 2D-klassifikaasje ûndergien, en nei elke run wurde de dieltsjes dy't foldogge oan it koalstofgebiet, de fersmoarging fan it stekproef, gjin dúdlike skaaimerken of sterk oerlappende dieltsjes ôfwiisd, wat resulteart yn 772.033 (90,9%) en 359.678 (75,5%) dieltsjes. De dieltsjes wurde brûkt foar de 3D-klassifikaasje fan respektivelik RC-LH114-W en RC-LH116. It earste 3D-referinsjemodel waard generearre mei de stochastyske gradiëntôfstammingsmetoade. Mei it earste model as referinsje wurde de selektearre dieltsjes yn 3D yn fjouwer kategoryen yndield. Mei it model yn dizze kategory as referinsje, fier 3D-raffinaazje út op 'e dieltsjes yn' e grutste kategory, brûk dan it earste 15Å leechpassfilter om it oplosmiddelgebiet te dekken, foegje 6 piksels sêfte rânen ta, en ferwurkje de piksels nei om de Gatan K2-piekmodulaasje-oerdrachtfunksje fan 'e boppeste detektor te korrigearjen. Foar de RC-LH114-W dataset waard dit earste model oanpast troch de sterke tichtens oan 'e rânen fan it masker te ferwiderjen (loskeppele fan 'e kearnkomplekstichtens yn UCSF Chimera). De resultearjende modellen (de resolúsjes fan RC-LH114-W en RC-LH116 binne respektivelik 3,91 en 4,16 Å) wurde brûkt as referinsje foar de twadde ronde fan 3D-klassifikaasje. De brûkte dieltsjes wurde groepearre yn 'e earste 3D-klasse en befetsje gjin sterke korrelaasje mei de buert. Oerlaap of gebrek oan dúdlike strukturele skaaimerken. Nei de twadde ronde fan 3D-klassifikaasje waard de kategory mei de heechste resolúsje selektearre [Foar RC-LH114-W is ien kategory 377.703 dieltsjes (44,5%), foar RC-LH116 binne d'r twa kategoryen, yn totaal 260.752 dieltsjes (54,7%), wêrby't se allinich itselde binne as se nei de earste rotaasje útrjochte binne mei in lyts ferskil]. De selektearre dieltsjes wurde opnij ekstrahearre yn in doaze fan 400 piksels en ferfine troch 3D-ferfining. It oplosmiddelmasker wurdt generearre mei it earste 15Å leechpassfilter, de útwreiding fan 3 piksels en it sêfte masker fan 3 piksels. Mei help fan CTF-ferfining per dieltsje, bewegingskorreksje per dieltsje en de twadde ronde fan CTF-ferfining per dieltsje, wurde 3D-ferfining, oplosmiddelmaskering en neiferwurking nei elke stap útfierd om de resultearjende tekstuer fierder te ferfine. Mei help fan de FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) grinswearde fan 0.143 binne de resolúsjes fan 'e definitive modellen fan RC-LH114-W en RC-LH116 respektivelik 2.65 en 2.80 Å. De FSC-kromme fan it definitive model wurdt werjûn yn figuer 2. S17.
Alle proteïnesekwinsjes binne ynladen fan UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) waard brûkt om in homologymodel fan RC te konstruearjen, dat de proteïnesekwinsjes fan RC-L, RC-M en RC-H en de kristalstruktuer fan Rba befettet. sphaeroides RC waard brûkt as in sjabloan (PDB ID: 5LSE) (46). Brûk de "fit map"-ark yn UCSF Chimera om it generearre model oan te passen oan de kaart (47), ferbetterje de proteïnestruktuer, en kofaktor [4×BChl a (monomeerbibleteekresidunamme = BCL), 2×BPh a (BPH), ien of twa soarten UQ10 (U10), ien net-heemizer (Fe) en ien 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] brûk Coot (48) om ta te foegjen. Omdat QAK net beskikber is yn 'e monomeerbibleteek, waard it parameterisearre mei de eLBOW-ark yn PHENIX (49).
Folgjende waard de LH1-subeenheid konstruearre. Yn it earstoan waard it automatyske konstruksje-ark yn PHENIX (49) brûkt om automatysk in diel fan 'e LH1-sekwinsje te konstruearjen mei de kaart en de LH1-α- en LH1-β-proteïnesekwinsjes as ynfier. Selektearje de meast folsleine LH1-subeenheid, ekstrahearje it en laad it yn Coot, foegje de ûntbrekkende sekwinsje manuell ta, en ferfine de heule struktuer manuell foardat twa BCls a (BCL) en in spirilloxanthine (CRT) tafoege wurde [neffens de relevante Rps De tichtens fan it LH1-kompleks en de bekende karotenoïde-ynhâld. Soarten (17)]. Kopiearje de folsleine LH1-subeenheid, en brûk de UCSF Chimera "Docking Map Tool" om it oanbuorjende net-modelgebiet fan LH1-tichtens te dockjen, en ferfine it dan yn Coot; werhelje it proses oant alle LH1-subienheden modellearre binne. Foar de RC-LH114-W-struktuer, troch it ekstrahearjen fan 'e net-tawiisde tichtens yn' e Coot, wurdt it proteïne segmentearre fan 'e oerbleaune net-proteïnekomponinten yn' e USCF Chimera-kaart en wurdt de Autobuild-ark brûkt om it earste model en de oerbleaune sub-ienheden (proteïne-W) te fêstigjen. Modellering. Yn PHENIX (49). Foegje alle ûntbrekkende sekwinsjes ta oan it resultearjende model yn Coot (48), en ferfine dan de heule sub-ienheid manuell. De oerbleaune net-tawiisde tichtens past by de kombinaasje fan lipiden (PDB monomeerbibleteek-ID fan CDL = CDL, POPC = 6PL en POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) en UQ10-molekulen (U10). Brûk PHENIX-optimalisaasje (49) en manuele optimalisaasje yn Coot (48) om it folsleine earste model te perfeksjonearjen oant de modelstatistiken en de fisuele kwaliteit fan 'e fit net fierder ferbettere wurde kinne. Brûk úteinlik LocScale (50) om de lokale kaart te skerpjen, en fier dan ferskate oare syklusen út fan it modellearjen fan 'e net-tawiisde tichtens en automatyske en manuele optimalisaasje.
De respektive peptiden, kofaktoren en oare lipiden en kinonen dy't binnen har respektive tichtheden oanlein binne, wurde werjûn yn figueren 1 en 2. S18 oant S23. De statistyske ynformaasje fan it definitive model wurdt werjûn yn tabel S1.
Behalven as oars oanjûn, waarden de UV/Vis/NIR-absorpsjespektra sammele op in Cary60-spektrofotometer (Agilent, Feriene Steaten) mei yntervallen fan 1 nm fan 250 nm oant 1000 nm en in yntegraasjetiid fan 0,1 sekonden.
Ferdund it stekproef yn in kwarts kuvette mei in 2 mm paad nei A880 fan 1, en sammelje it absorpsjespektrum tusken 400 en 1000 nm. De sirkelfoarmige dichroïske spektra waarden sammele op in Jasco 810 spektropolarimeter (Jasco, Japan) mei yntervallen fan 1 nm tusken 400 nm en 950 nm mei in scansnelheid fan 20 nm min-1.
De molêre ekstinsjekoëffisjint wurdt bepaald troch it kearnkompleks te ferdunnen ta in A880 fan sawat 50. Ferdun it 10μl folume yn 990μl bindingsbuffer of metanol, en sammelje it absorpsjespektrum fuortendaliks om BChl-degradaasje te minimalisearjen. De BChl-ynhâld fan elk metanolmonster waard berekkene troch de ekstinsjekoëffisjint by 771 nm fan 54,8 mM-1 cm-1, en de ekstinsjekoëffisjint waard bepaald (51). Diel de mjitten BChl-konsintraasje troch 32 (RC-LH114-W) of 36 (RC-LH116) om de kearnkomplekskonsintraasje te bepalen, dy't dan brûkt wurdt om it absorpsjespektrum fan itselde monster te bepalen dat yn 'e buffer parallel sammele is. Trije werhelle mjittingen waarden nommen foar elk monster, en de gemiddelde absorpsje fan it BChl Qy-maksimum waard brûkt foar de berekkening. De ekstinksjekoëffisjint fan RC-LH114-W metten by 878 nm is 3280 ± 140 mM-1 cm-1, wylst de ekstinksjekoëffisjint fan RC-LH116 metten by 880 nm 3800 ± 30 mM-1 cm-1 is.
UQ10 waard kwantifisearre neffens de metoade yn (52). Koartsein, omkearde faze HPLC (RP-HPLC) waard útfierd mei it Agilent 1200 HPLC-systeem. Los sawat 0,02 nmol RC-LH116 of RC-LH114-W op yn 50 μl fan 50:50 methanol:chloroform mei 0,02% (w/v) ferrichloride, en ynjeksjearje de foar-lykwichtich makke Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Oplosse yn 1 ml-1 min-1 by 40 °C yn HPLC-oplosmiddel (80:20 methanol:2-propanol) op in ×25 cm kolom. Fier isokratyske elúsje út yn in HPLC-oplosmiddel om de absorbânsje te kontrolearjen by 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoïden) en 780 nm (BChl) foar 1 oere. De pyk yn it 275 nm chromatogram nei 25,5 minuten waard yntegrearre, en befette gjin oare detektearbere ferbiningen. It yntegrearre gebiet wurdt brûkt om de molêre hoemannichte UQ10 te berekkenjen dy't ekstrahearre is mei ferwizing nei de kalibraasjekromme berekkene út 'e ynjeksje fan suvere standerts fan 0 oant 5,8 nmol (figuer S14). Elk stekproef waard analysearre yn trije replikaten, en de rapportearre flater komt oerien mei de SD fan it gemiddelde.
In oplossing mei it RC-LH1-kompleks mei in maksimale Qy-absorpsje fan 0.1 waard taret mei 30 μM redusearre hynstehertcytochroom c2 (Merck, UK) en 0 oant 50 μMUQ2 (Merck, UK). Trije 1-ml samples waarden taret by elke UQ2-konsintraasje en oernachtich yn it tsjuster by 4°C ynkubearre om folsleine oanpassing oan it tsjuster te garandearjen foar de mjitting. De oplossing waard yn in OLIS RSM1000 modulêre spektrofotometer laden mei in 300 nm flam/500 line-raster, 1.24 mm ynlaat, 0.12 mm midden en 0.6 mm útlaatspleten. In 600 nm lang passfilter wurdt pleatst by de yngong fan 'e samplefotobuis en de referinsjefotomultiplikatorbuis om eksitaasjeljocht út te sluten. De absorpsje waard kontroleare by 550 nm mei in yntegraasjetiid fan 0.15 s. It eksitaasjeljocht wurdt útstjoerd fan 'e 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) fia in glêstriedkabel mei in yntensiteit fan 90% fia in DC2200-controller (Thorlabs Ltd., UK) en wurdt útstjoerd nei de ljochtboarne ûnder in hoeke fan 90°. De mjitstriel is tsjinoer de spegel om alle ljocht werom te jaan dat net yn earste ynstânsje troch it stekproef absorbearre waard. Monitorearje de absorbânsje 10 sekonden foar de ferljochtingssterkte fan 50 sekonden. Dêrnei waard de absorbânsje fierder 60 sekonden yn it tsjuster kontroleare om te beoardieljen yn hoefier't kinolol spontaan cytochroom c23+ ferminderet (sjoch figuer S8 foar rûge gegevens).
De gegevens waarden ferwurke troch in lineêre begjinsnelheid oan te passen binnen 0,5 oant 10 s (ôfhinklik fan 'e UQ2-konsintraasje) en de tariven fan alle trije samples by elke UQ2-konsintraasje te middelen. De RC-LH1-konsintraasje berekkene troch de respektive ekstinksjekoëffisjint waard brûkt om de snelheid om te setten yn 'e katalytyske effisjinsje, plotte yn Origin Pro 2019 (OriginLab, Feriene Steaten), en oanpast oan it Michaelis-Menten-model om de skynbere Km- en Kcat-wearden te bepalen.
Foar tydlike absorpsjemjittingen waard it RC-LH1-monster ferdund ta ~2μM yn IMAC-buffer mei 50 mM natriumascorbaat (Merck, FS) en 0.4 mM Terbutine (Merck, FS). Ascorbinezuur wurdt brûkt as in opofferjende elektrondonor, en tert-butaclofen wurdt brûkt as in QB-remmer om te soargjen dat de wichtichste RC-donor redusearre bliuwt (dat is, net fotooksidearre) tidens it mjitproses. Sawat 3 ml fan it monster wurdt tafoege oan in oanpaste rotearjende sel (sawat 0.1 m yn diameter, 350 RPM) mei in optyske paadlingte fan 2 mm om te soargjen dat it monster yn it laserpaad genôch tiid hat foar tsjustere oanpassing tusken eksitaasjepulsen. Brûk ~100-fs laserpulsen om it Ti: Sapphire-lasersysteem (Spectra Physics, FS) te fersterkjen om it monster te eksitearjen by 880 nm mei in werhellingsfrekwinsje fan 1 kHz (20 nJ foar NIR of 100 nJ foar Vis). Foardat jo gegevens sammelje, stel it monster sawat 30 minuten bleat oan eksitaasjeljocht. Bleatstelling sil QA-inaktivaasje feroarsaakje (mooglik ien of twa kear in fermindering fan QA). Mar tink derom dat dit proses omkearber is, om't nei in lange perioade fan tsjustere oanpassing, RC stadich weromkomt nei QA-aktiviteit. In Helios-spektrometer (Ultrafast Systems, FS) waard brûkt om tydlike spektra te mjitten mei in fertraging fan -10 oant 7000 ps. Brûk Surface Xplorer-software (Ultrafast Systems, FS) om de datasets te ûntgroepearjen, dan te gearfoegjen en te standardisearjen. Brûk it CarpetView-softwarepakket (Light Conversion Ltd., Litouwen) om de kombineare dataset te brûken om differinsjaalspektra te krijen dy't relatearre binne oan ferfal, of brûk in funksje dy't meardere eksponinten konvoluearret mei de ynstrumintrespons om te passen by de spektrale evolúsje fan ien golflingte yn Origin (OriginLab, FS).
Lykas hjirboppe neamd (53), waard in fotosyntetyske film mei it LH1-kompleks taret, sûnder sawol RC as perifeare LH2-antenne. It membraan waard ferdund yn 20 mM tris (pH 8.0) en doe yn in kwarts-kuvette mei in optysk paad fan 2 mm laden. In laserpuls fan 30 nJ waard brûkt om it stekproef by 540 nm te stimulearjen mei in fertraging fan -10 oant 7000 ps. Ferwurkje de dataset lykas beskreaun foar it Rps. pal-steekproef.
It membraan waard pelletearre troch sintrifugaasje by 150.000 RCF foar 2 oeren by 4 °C, en doe waard de absorbânsje by 880 nm opnij suspendearre yn 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en 200 mM NaCl. Los it membraan op troch stadich te roeren yn 2% (w/v) β-DDM foar 1 oere yn it tsjuster by 4 °C. It monster waard verdund yn 100 mM triethylammoniumkarbonaat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) oant in proteïnekonsintraasje fan 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyze). Fierdere ferwurking waard útfierd fan 'e earder publisearre metoade (54), begjinnend mei de verdunning fan 50 μg proteïne yn in totaal fan 50 μl TEAB mei 1% (w/v) natriumlauraat (Merck, UK). Nei sonikaasje foar 60 sekonden waard it redusearre mei 5 mM tris(2-karboksyetyl)fosfine (Merck, UK) by 37 °C foar 30 minuten. Foar S-alkylaasje, ynkubearje it stekproef mei 10 mM methyl S-methylthiomethaansulfonaat (Merck, UK) en foegje it ta út in 200 mM isopropanol-stamoplossing foar 10 minuten by keamertemperatuer. Proteolytyske spiisfertarring waard útfierd troch 2 μg trypsine/endoproteinase Lys-C-mingsel (Promega UK) ta te foegjen en 3 oeren by 37 °C te ynkubearjen. De lauraat-surfactant waard ekstrahearre troch 50 μl etylacetaat en 10 μl 10% (v/v) LC-kwaliteit trifluorazijnzuur (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ta te foegjen en 60 sekonden te vortexen. De fazeskieding waard befoardere troch sintrifugaasje by 15.700 RCF foar 5 minuten. Neffens it protokol fan 'e fabrikant waard in C18-spinkolom (Thermo Fisher Scientific, UK) brûkt om de legere faze mei it peptide foarsichtich op te sûgjen en te ûntsâlten. Nei it droegjen troch fakuümsintrifugaasje waard it monster oplost yn 0,5% TFA en 3% acetonitril, en 500 ng waard analysearre troch nanoflow RP-chromatografy keppele oan massaspektrometry mei de systeemparameters dy't earder detaillearre binne.
Brûk MaxQuant v.1.5.3.30 (56) foar proteïne-identifikaasje en kwantifikaasje om te sykjen nei de Rps. palustris proteome-database (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). De massaspektrometry-proteomika-gegevens binne opslein yn 'e ProteomeXchange Alliance fia de PRIDE-partnerrepository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ûnder de dataset-identifikator PXD020402.
Foar analyse troch RPLC keppele oan elektrospray-ionisaasjemassaspektrometry, waard it RC-LH1-kompleks taret út wild-type Rps. Mei de earder publisearre metoade (16) wie de proteïnekonsintraasje produsearre yn palustris-sellen 2 mg ml-1 yn 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl en 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad-analyse)) DDM. Neffens it protokol fan 'e fabrikant, brûk in 2D-suveringskit (GE Healthcare, FS) om 10 μg proteïne te ekstrahearjen troch de delslachmetoade, en los de delslach op yn 20 μl 60% (v/v) mierensoer (FA), 20% (v/v) acetonitril en 20% (v/v) wetter. Fiif mikroliter waarden analysearre troch RPLC (Dionex RSLC) keppele oan massaspektrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Brûk in MabPac 1.2×100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, UK) foar skieding by 60°C en 100μlmin-1, mei in gradiënt fan 85% (v/v) oplosmiddel A [0.1% (v/v) FA en 0.02% (V/v) TFA wetterige oplossing] oant 85% (v/v) oplosmiddel B [0.1% (v/v) FA en 0.02% (v/v) yn 90% (v/v) acetonitril TFA]. Mei help fan in standert elektrospray-ionisaasjeboarne en standertparameters foar mear as 60 minuten, krijt de massaspektrometer in ferhâlding fan 100 oant 2750 m/z (massa-oant-ladingferhâlding). Mei help fan 'e ExPASy bioinformatica-boarneportaal FindPept-ark (https://web.expasy.org/findpept/), mappje it massaspektrum nei de sub-ienheden fan it kompleks.
De sellen waarden 72 oeren lang groeid ûnder 100 ml NF-leech (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) of heech (300μMm-2 s-1) ljocht. M22-medium (M22-medium wêryn ammoniumsulfaat weilitten is en natriumsuccinaat ferfongen is troch natriumasetaat) yn in skroefdopflesse fan 100 ml (23). Yn fiif syklusen fan 30 sekonden waarden glêskralen fan 0,1 mikron yn in folumeferhâlding fan 1:1 tafoege om de sellen te lysearjen en 5 minuten op iis te koelen. De ûnoplosbere matearje, ûnbrutsen sellen en glêskralen waarden fuorthelle troch sintrifugaasje by 16.000 RCF foar 10 minuten yn in benchtop-mikrosentrifuge. It membraan waard skieden yn in Ti 70.1 rotor mei 100.000 RCF yn 20 mM tris-HCl (pH 8.0) mei in 40/15% (w/w) sukrosegradiënt foar 10 oeren.
Lykas beskreaun yn ús eardere wurk, immunodeteksje fan 'e His-tag op PufW (16). Koartsein, it suvere kearnkompleks (11.8 nM) of it membraan mei deselde konsintraasje fan RC (bepaald troch oksidaasje, it ferminderjen fan it fermindere ferskilspektrum en it oerienkommen fan 'e lading op 'e kleurde gel) yn 2x SDS-laadbuffer (Merck, UK) twa kear ferdund. De proteïnen waarden skieden op in replika 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, UK). In gel waard kleurd mei Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) om de RC-L-subeenheid te laden en te visualisearjen. It proteïne op 'e twadde gel waard oerdroegen nei in metanol-aktivearre polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Thermo Fisher Scientific, UK) foar immunoassay. It PVDF-membraan waard blokkearre yn 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 en 5% (w/v) skimme molkepoeier, en doe ynkubearre mei it anti-His primêre antistof (yn verdunde antistofbuffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl en 0.05% (v/v) Tween-20] yn 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Feriene Steaten) foar 4 oeren. Nei it 3 kear waskjen foar 5 minuten yn antistofbuffer, waard it membraan kombinearre mei mierikswortelperoxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mûs sekundêr antistof (ferdun 1:10.000 yn antistofbuffer). Ynkubearje om deteksje mooglik te meitsjen (5 minuten nei 3 waskjes yn antistofbuffer) mei help fan WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substraat (Cyanagen, Italië) en Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Troch de yntensiteitsferdieling fan elke kleurde gel- of immunoassaybaan te tekenjen, it gebiet ûnder de pyk te yntegrearjen en de yntensiteitsferhâlding fan RC-L (kleurde gel) en Protein-W (immunoassay) te berekkenjen, yn ImageJ (57) Ferwurkje de ôfbylding. Dizze ferhâldingen waarden omset yn molêre ferhâldingen troch oan te nimmen dat de ferhâlding fan RC-L ta protein-W yn it suvere RC-LH114-W-monster 1:1 wie en de heule dataset dêrop te normalisearjen.
Foar oanfoljende materialen foar dit artikel, sjoch http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dit is in iepen tagongsartikel ferspraat ûnder de betingsten fan 'e Creative Commons Attribution License. It artikel lit ûnbeheind gebrûk, distribúsje en reproduksje ta yn elk medium ûnder de betingst dat it orizjinele wurk goed sitearre wurdt.
Opmerking: Wy freegje jo allinich om jo e-mailadres op te jaan, sadat de persoan dy't jo oanbefelje oan 'e pagina wit dat jo wolle dat se de e-mail sjogge en dat it gjin spam is. Wy sille gjin e-mailadressen fêstlizze.
Dizze fraach wurdt brûkt om te testen oft jo in besiker binne en automatyske spamferstjoering te foarkommen.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
De hege-resolúsje struktuer fan it ljochtfal 1-kompleks yn it reaksjesintrum jout nije ynsjoggen yn 'e kinondynamika.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
De hege-resolúsje struktuer fan it ljochtfal 1-kompleks yn it reaksjesintrum jout nije ynsjoggen yn 'e kinondynamika.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rjochten foarbehâlden. AAAS is in partner fan HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.